Geautomatiseerde detectie en analyse van exocytose
Summary
We ontwikkelden geautomatiseerde computer vision software om exocytische gebeurtenissen te detecteren die worden gekenmerkt door pH-gevoelige fluorescentiesondes. Hier demonstreren we het gebruik van een grafische gebruikersinterface en RStudio om fusiegebeurtenissen te detecteren, spatiotemporale parameters van fusie te analyseren en weer te geven en gebeurtenissen in verschillende fusiemodi te classificeren.
Abstract
Timelapse TIRF-microscopie van pH-gevoelige GFP (pHluorine) verbonden aan blaasjes SNARE-eiwitten is een effectieve methode om exocytische gebeurtenissen in het celkweek van één blaasje te visualiseren. Om een onbevooroordeete, efficiënte identificatie en analyse van dergelijke gebeurtenissen uit te voeren, werd een computervisiegebaseerde aanpak ontwikkeld en geïmplementeerd in MATLAB. De analyse pijplijn bestaat uit een algoritme voor cel segmentatie en exocytische gebeurtenis identificatie. De computervisiebenadering omvat hulpmiddelen voor het onderzoeken van meerdere parameters van afzonderlijke gebeurtenissen, waaronder de halfwaardetijd van fluorescentiebederf en piek ΔF/F, evenals analyse van de frequentie van exocytose in hele cellen. Deze en andere parameters van fusie worden gebruikt in een classificatiebenadering om verschillende fusiemodi te onderscheiden. Hier voert een nieuw gebouwde GUI de analysepijplijn van begin tot eind uit. Verdere aanpassing van Ripley’s K-functie in R Studio wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen geclusterde, verspreide of willekeurige voorkomen van fusiegebeurtenissen in zowel ruimte als tijd.
Introduction
VAMP-pHluorine constructen of transferrine receptor (TfR)-pHuji constructies zijn uitstekende markers van exocytische gebeurtenissen, omdat deze pH-gevoelige fluoroforen worden gedoofd in het zure blaasje lumen en fluoresce onmiddellijk na fusie porie opening tussen het blaasje en plasmamembraan1. Na het openen van de fusieporiën vergaat fluorescentie exponentieel, met enige heterogeniteit die informatie over de fusiegebeurtenis onthult. Hier wordt een GUI-toepassing (Graphical User Interface) beschreven die automatisch exocytische gebeurtenissen detecteert en analyseert. Met deze applicatie kan de gebruiker automatisch exocytische gebeurtenissen detecteren die worden onthuld door pH-gevoelige markers2 en functies genereren van elke gebeurtenis die kan worden gebruikt voor classificatiedoeleinden3 (Figuur 1A). Daarnaast wordt analyse van exocytische gebeurtenisclustering met behulp van ripley’s K-functie beschreven.
De geautomatiseerde classificatie van exocytische gebeurtenissen in verschillende exocytische modi werd onlangs gerapporteerd3. Twee modi van exocytose, full-vesicle fusion (FVF) en kiss-and-run fusion (KNR) exocytose zijn eerder beschreven4,5,6,7. Tijdens FVF verwijdt de fusieporiën en wordt het blaasje opgenomen in het plasmamembraan. Tijdens KNR opent de fusieporiën tijdelijk en hersealen vervolgens4,5,8,9,10. Vier modi van exocytose werden geïdentificeerd in het ontwikkelen van neuronen, twee gerelateerd aan FVF en twee gerelateerd aan KNR. Dit werk toont aan dat zowel FVF als KNR verder kunnen worden onderverdeeld in fusiegebeurtenissen die onmiddellijk overgaan tot fluorescentiebederf (FVFi en KNRi) na het openen van de fusieporiën of exocytische gebeurtenissen die een vertraging vertonen na het openen van de fusieporiën voordat fluorescentieverval begint (FVFd en KNRd) (Figuur 1B). De classificatie identificeert de modus van exocytose voor elke fusiegebeurtenis. Hier is deze analyse opgenomen in een GUI die kan worden geïnstalleerd in MATLAB in Windows- en Mac-gebaseerde besturingssystemen. Alle analysebestanden zijn te vinden op https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing of
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Houd er bij het gebruik van de exocytische detectie- en analysesoftware rekening mee dat het programma alleen compressie zonder verlies accepteert .tif bestanden als invoer. De .tif afbeeldingsbestanden kunnen 8-bits, 16-bits of 32-bits grijswaardenafbeeldingen (één kanaal) zijn. Andere afbeeldingsindelingen moeten vóór invoer worden geconverteerd naar een van deze typen. Ter referentie, voorbeelden die hier worden gebruikt, zijn 16-bits grijswaardenafbeeldingen.
Inherent aan het geautomat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dustin Revell en Reginald Edwards voor het testen van code en de GUI. De nationale instituten voor gezondheid ondersteunden dit onderzoek: waaronder R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) en F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
Riferimenti
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
