Wir haben eine automatisierte Computer-Vision-Software entwickelt, um exozytäre Ereignisse zu erkennen, die durch pH-sensitive Fluoreszenzsonden gekennzeichnet sind. Hier demonstrieren wir die Verwendung einer grafischen Benutzeroberfläche und RStudio, um Fusionsereignisse zu erkennen, räumlich-zeitliche Parameter der Fusion zu analysieren und anzuzeigen und Ereignisse in verschiedene Fusionsmodi zu klassifizieren.
Die Zeitraffer-TIRF-Mikroskopie von pH-sensitivem GFP (pHluorin), das an Vesikel-SNARE-Proteine gebunden ist, ist eine effektive Methode, um exozytäre Ereignisse einzelner Vesikel in Zellkulturen sichtbar zu machen. Um eine unvoreingenommene, effiziente Identifizierung und Analyse solcher Ereignisse durchzuführen, wurde ein Computer-Vision-basierter Ansatz entwickelt und in MATLAB implementiert. Die Analysepipeline besteht aus einem Zellsegmentierungs- und exozyttischen Ereignisidentifikationsalgorithmus. Der Computer-Vision-Ansatz umfasst Werkzeuge zur Untersuchung mehrerer Parameter einzelner Ereignisse, einschließlich der Halbwertszeit des Fluoreszenzzerfalls und des Peak-ΔF / F sowie der Ganzzellanalyse der Häufigkeit der Exozytose. Diese und andere Parameter der Fusion werden in einem Klassifikationsansatz verwendet, um verschiedene Fusionsmodi zu unterscheiden. Hier führt eine neu erstellte GUI die Analysepipeline von Anfang bis Ende durch. Eine weitere Anpassung von Ripleys K-Funktion in R Studio wird verwendet, um zwischen geclusterten, dispergierten oder zufälligen Auftreten von Fusionsereignissen in Raum und Zeit zu unterscheiden.
VAMP-pHluorin-Konstrukte oder Transferrinrezeptor (TfR)-pHuji-Konstrukte sind ausgezeichnete Marker für exozytäre Ereignisse, da diese pH-sensitiven Fluorophore im sauren Vesikellumen abgeschreckt werden und unmittelbar nach der Fusionsporenöffnung zwischen Vesikel und Plasmamembran fluoreszieren1. Nach der Öffnung der Fusionsporen zerfällt die Fluoreszenz exponentiell, mit einer gewissen Heterogenität, die Informationen über das Fusionsereignis preisgibt. Hier wird eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) beschrieben, die exozytäre Ereignisse automatisch erkennt und analysiert. Diese Anwendung ermöglicht es dem Benutzer, exozytäre Ereignisse, die durch pH-empfindliche Marker2 aufgedeckt werden, automatisch zu erkennen und aus jedem Ereignis Merkmale zu generieren, die für Klassifizierungszwecke verwendet werden können3 (Abbildung 1A). Zusätzlich wird die Analyse des exozyttischen Ereignisclusterings mit Ripleys K-Funktion beschrieben.
Die automatisierte Klassifizierung exozytischer Ereignisse in verschiedene exozytäre Modi wurde kürzlich berichtet3. Zwei Modi der Exozytose, die Vollvesikelfusion (FVF) und die Kiss-and-Run-Fusion (KNR) Exozytose, wurden zuvor beschrieben4,5,6,7. Während der FVF erweitert sich die Fusionspore und das Vesikel wird in die Plasmamembran eingebaut. Während des KNR öffnet sich die Fusionspore vorübergehend und verschließt dann4, 5,8,9,10. Vier Modi der Exozytose wurden in sich entwickelnden Neuronen identifiziert, zwei verwandt mit FVF und zwei mit KNR. Diese Arbeit zeigt, dass sowohl FVF als auch KNR weiter unterteilt werden können in Fusionsereignisse, die unmittelbar zum Fluoreszenzzerfall (FVFi und KNRi) nach Fusionsporenöffnung übergehen, oder exozytäre Ereignisse, die eine Verzögerung nach der Fusionsporenöffnung aufweisen, bevor der Fluoreszenzzerfall beginnt (FVFd und KNRd) (Abbildung 1B). Der Klassifikator identifiziert den Modus der Exozytose für jedes Fusionsereignis. Hier wurde diese Analyse in eine GUI integriert, die in MATLAB in Windows- und Mac-basierten Betriebssystemen installiert werden kann. Alle Analysedateien finden Sie unter https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing oder
https://github.com/GuptonLab.
Bitte beachten Sie bei der Verwendung der exozytischen Erkennungs- und Analysesoftware, dass das Programm nur verlustfreie Komprimierung .tif Dateien als Eingabe akzeptiert. Die .tif Bilddateien können 8-Bit-, 16-Bit- oder 32-Bit-Graustufenbilder (Einzelkanal) sein. Andere Bildformate müssen vor der Eingabe in einen dieser Typen konvertiert werden. Als Referenz werden hier Beispiele als 16-Bit-Graustufenbilder verwendet.
Im Rahmen des automatisierten Erkennungsprozesses werden die Zeitraffer…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dustin Revell und Reginald Edwards für das Testen von Code und GUI. Die Finanzierung wurde von den National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, die diese Forschung unterstützten: einschließlich R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) und F31NS103586 (FLU).
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