Articolo metodologico

Un modello chirurgico modificato di ischemia dell'arto posteriore in ApoE-/- Topi utilizzando un'incisione in miniatura

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DOI:

10.3791/62402

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13 maggio 2021

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1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo dimostra un approccio chirurgico efficiente per stabilire l'ischemia acuta nei topi con una piccola incisione. Questo approccio può essere applicato dalla maggior parte dei gruppi di ricerca senza aggiornamenti di laboratorio.

Abstract

Lo scopo di questo studio è quello di introdurre e valutare un approccio chirurgico modificato per indurre ischemia acuta nei topi che può essere implementato nella maggior parte dei laboratori animali. Contrariamente all'approccio convenzionale per la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), è stata praticata un'incisione più piccola sulla regione inguinale destra per esporre l'arteria femorale prossimale (FA) per eseguire DLFA. Quindi, utilizzando una sutura 7-0, l'incisione è stata trascinata nella regione del ginocchio per esporre la FA distale. La risonanza magnetica (MRI) sugli arti posteriori bilaterali è stata utilizzata per rilevare l'occlusione FA dopo l'intervento chirurgico. A 0, 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico, il recupero funzionale degli arti posteriori è stato valutato visivamente e classificato utilizzando la scala di Tarlov. La valutazione istologica è stata eseguita dopo l'eutanasia degli animali 7 giorni dopo il DLFA. Le procedure sono state eseguite con successo sulla gamba destra in dieci topi ApoE-/- e nessun topo è morto durante la successiva osservazione. Le dimensioni dell'incisione in tutti e 10 i topi erano inferiori a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). I risultati della risonanza magnetica hanno mostrato che il flusso sanguigno FA nel lato ischemico era chiaramente bloccato. I risultati della scala di Tarlov hanno dimostrato che la funzione dell'arto posteriore è diminuita significativamente dopo la procedura e lentamente recuperata nei successivi 7 giorni. La valutazione istologica ha mostrato una significativa risposta infiammatoria sul lato ischemico e una ridotta densità microvascolare nell'arto posteriore ischemico. In conclusione, questo studio introduce una tecnica modificata che utilizza un'incisione in miniatura per eseguire l'ischemia degli arti posteriori (HLI) utilizzando DLFA.

Introduzione

C'è un bisogno insoddisfatto di modelli animali preclinici per la ricerca nelle malattie vascolari come la malattia delle arterie periferiche (PAD). Nonostante gli sviluppi avanzati nella diagnosi e nel trattamento, ci sono stati più di 200 milioni di pazienti con PAD nel 20181e il loro numero è in costante aumento. Sebbene siano stati descritti diversi nuovi approcci terapeutici2,3,4,5,6,7, la traduzione di successo di queste modalità terapeutiche in applicazione clinica rimane un compito scoraggiante. Pertanto, sono necessari modelli sperimentali in vivo affidabili e pertinenti che simulino la condizione della malattia umana per studiare il potenziale meccanismo e l'efficienza di questi nuovi approcci terapeutici per il trattamento della PAD6,7.

L'iperlipidemia e l'aterosclerosi (AS) sono i principali fattori di rischio per lo sviluppo della PAD. I topi ApoE-/- (con una dieta ricca di grassi) mostrano un metabolismo anormale dei grassi e iperlipidemia e successivamente sviluppano placche aterosclerotiche che rendono i topi ApoE-/- la scelta migliore per simulare la PAD clinicamente rilevante. I modelli animali HLI preclinici sono generati attraverso la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), che è l'approccio più utilizzato nei laboratori di tutto il mondo8,9,10,11,12,13,14,15 per simulare l'ischemia acuta su cronica. Tuttavia, questo approccio di solito richiede un'incisione relativamente grande e invasiva. Inoltre, porta inevitabilmente agli animali (soprattutto topi) che soffrono di aumento delle lesioni da dolore e dell'infiammazione, che influenza anche i successivi risultati sperimentali5,6,16,17. Questo articolo descrive un modello HLI acuto su cronico nei topi APOE-/- utilizzando un'incisione molto piccola.

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Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo la linea guida CE CE 2010/63/UE e sono state approvate dalla legislazione locale tedesca (35-9185.81/G[1]239/18). Dieci topi ApoEmaschi -/- con fondo C57BL / 6J, del peso di 29,6-38,0 g, sono stati alloggiati su un ciclo di luce / buio di 12 ore e alimentati con una dieta occidentale (1,25% di colesterolo e 21% di grassi) e acqua ad libitum per 12 settimane dall'età di 8 settimane. HLI è stato eseguito su topi di 20 settimane come descritto di seguito.

1. Induzione di HLI in topi ApoE-/-

  1. Preparare le attrezzature e gli strumenti necessari per la chirurgia (vedere la Tabella dei materiali e la Figura 1). Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave prima dell'uso e utilizzare uno sterilizzatore per perline di vetro durante l'operazione.
  2. Anestetizzare il topo con un'iniezione sottocutanea (S.C.) di una miscela di midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) e fentanil (0,5 mg/kg) prima di tutte le procedure chirurgiche.
    1. Dopo l'inizio dell'anestesia, utilizzare l'unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza e confermare l'assenza del riflesso di astinenza del pedale nell'arto anteriore e posteriore.
  3. Successivamente posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea interna a circa 37 °C. Utilizzando tamponi di cotone e crema per la depilazione, rimuovere con cura i peli dalla pelle degli arti posteriori sul lato destro.
    NOTA: La crema depilatoria deve essere utilizzata in quantità sufficiente a coprire l'arto posteriore, in particolare la regione inguinale in cui verrà praticata l'incisione. La crema depilazione deve essere utilizzata per una durata inferiore a 3 minuti e deve essere successivamente rimossa con tamponi di cotone inumiditi da 2 a 3 volte.
  4. Posare il mouse in posizione supina sulla piastra riscaldante sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare un antisettico cutaneo (vedi tabella dei materiali)per disinfettare la pelle del topo. Successivamente, utilizzare pinze appuntite e forbici chirurgiche per praticare un'incisione di circa 3-4 mm nel mezzo della regione inguinale. Vedere la Figura 2 per uno schema della procedura.
  5. Rimuovere accuratamente il tessuto adiposo sottocutaneo con l'aiuto di pinze appuntite per esporre il fascio neurovascolare femorale prossimale. Utilizzare con attenzione la pinza a punta fine per perforare la membrana della guaina femorale. Utilizzare un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina per spostare l'arteria femorale (FA) con attenzione lontano dal nervo femorale (FN) e dalla vena femorale (FV).
  6. Passa due suture assorbibili 7-0 attraverso la FA prossimale e fai doppi nodi usando le forbici a molla per transettare la FA tra i due legami.
  7. Per esporre la FA distale, passare una sutura assorbibile 7-0 attraverso il bordo inferiore dell'incisione e trascinare delicatamente l'incisione nella regione del lato destro del ginocchio dell'arto posteriore.
  8. Spostare il tessuto sottocutaneo da parte con attenzione per esporre il fascio neurovascolare. Utilizzare pinze a punta fine per perforare la membrana della guaina femorale e sezionare la FA da FV e FN.
  9. Passa due suture assorbibili 7-0 attraverso la FA distale e fai doppi nodi. Usa le forbici a molla per transettare la FA tra le due cravatte.
    NOTA: nessuna legatura è stata eseguita sull'arto sinistro, che fungeva da controllo in ciascun mouse.
  10. Successivamente, utilizzare 6-0 suture riassorbibili per cucire l'incisione. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante in una gabbia pulita e continuare a monitorare i suoi parametri vitali fino al recupero. Fornire analgesici postoperatori: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg di peso corporeo ogni 8 ore per 48 ore). 48 ore dopo l'operazione, somministrare metamizolo in acqua potabile (24 mg/5mL di acqua corrispondono a una dose di 200 mg/kg 4 volte al giorno).

2. Risonanza magnetica

NOTA: Un giorno dopo DLFA, i topi devono sottoporsi a scansioni MRI per valutare il blocco FA.

  1. Posizionare il mouse in una camera di induzione trasparente e anestetizzare il mouse con l'1,5-2% di isoflurano nell'aria ambiente fino alla perdita del riflesso di raddrizzamento.
  2. Posizionare il mouse su un letto per animali riscaldato dotato di un porta morso e posizionato verso il magnete con un sistema controllato dal laser. Mantenere la temperatura corporea a 37±1 °C.
  3. Durante l'acquisizione delle immagini, mantenere l'anestesia con l'1,5-2% di isoflurano nell'aria ambiente e monitorare la respirazione utilizzando una sonda di pressione.
  4. Acquisire immagini nell'orientamento trasversale della fetta utilizzando una sequenza angiografica tridimensionale (3D) time of flight (TOF) con parametro echo time (TE)/tempo di ripetizione (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quattro medie, una matrice di acquisizione di 178 x 144 ricostruita a 256 x 192 e 121 fette, con conseguente risoluzione isotropa di 0,15 mm3. Per sopprimere il segnale dalle vene, posizionare una fetta di saturazione distalmente agli arti posteriori.

3. Valutazione clinica e follow-up

  1. Stimare il recupero funzionale nel1°,3°,5°e7° giorno dopo l'intervento chirurgico utilizzando il punteggio funzionale della scala di Tarlov18,19 (Tabella 1).

4. Valutazione istologica

  1. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, applicare l'iniezione di pentobarbital (115 mg / kg) per eutanasizzare i topi.
  2. Perfondere la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di paraformaldeide (PFA) attraverso il ventricolo cardiaco sinistro (100 ml per topo). Fissare il gastrocnemio bilaterale (Gm) dei topi in PFA al 4% durante la notte a 4 °C.
  3. Incorporare il campione in paraffina secondo il protocollo20precedentemente descritto.
    1. Tagliare sezioni spesse 4-5 μm del blocco di tessuto incorporato nella paraffina su un microtomo. Con l'aiuto di un pennello rotondo, posizionare le sezioni di tessuto tagliate nel bagno d'acqua mantenute a 42 ° C.
    2. Inserire il vetrino del microscopio nell'acqua con un angolo di 45° e posizionarlo con attenzione sotto il gruppo di sezioni da raccogliere.
    3. Sollevare con attenzione lo scivolo dall'acqua e lasciare che le sezioni si attacchino allo scivolo e asciugare durante la notte nell'incubatrice da banco a 37 °C.
  4. Eseguire la colorazione ematossilina/eosina (HE) delle sezioni di paraffina.
    1. Posizionare le diapositive contenenti le sezioni nei porta diapositive. Preparare 3 contenitori di xilene fresco e posizionare i vetrini in ogni contenitore per 5 minuti per deparaffinizzare le sezioni.
    2. Reidratare le sezioni immergendo le fette successivamente in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% di etanolo e acqua deionizzata per 5 minuti ciascuna.
    3. Macchiare in soluzione di ematossilina per 10 minuti.
    4. Trasferire le fette in un contenitore di acqua deionizzata e risciacquare mettendo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
    5. Utilizzando un microscopio, controllare l'intensità della colorazione ematossilina. Se la colorazione consente di identificare chiaramente i nuclei cellulari, continuare con il passaggio successivo. Se l'intensità della colorazione non facilita l'identificazione dei nuclei cellulari o se l'intensità della colorazione è debole, posizionare il vetrino nella soluzione di ematossilina per 1 minuto, ripetere il lavaggio con acqua (passaggio 4.4.4) e quindi controllare di nuovo.
    6. Contromacchia in soluzione di eosina-Y per 5 min.
    7. Disidratare le sezioni immergendo successivamente le fette in contenitori contenenti acqua deionizzata e etanolo al 30%, 50%, 70%, 80% e 96% successivamente per una durata di 10 s ciascuno. Quindi, posizionare le sezioni in sequenza in tre contenitori di xilene fresco per 10 s ciascuno.
    8. Posizionare le diapositive orizzontalmente su microscopiche mappe di memorizzazione delle diapositive con le sezioni rivolte verso l'alto. Aggiungere abbastanza supporto di montaggio sulla diapositiva e montare le diapositive con i coverslip.
  5. Eseguire la colorazione immunoistochimica (IHC) delle sezioni di paraffina.
    1. Ripetere le fasi di deparaffinazione e reidratazione 4.4.1-4.4.2. Quindi, immergere le sezioni in un contenitore con tampone di citrato di sodio da 10 mM, pH 6 e portare il campione a ebollizione in un forno a microonde.
      NOTA: poiché il surriscaldamento o il surriscaldamento dei campioni può causare macchie incoerenti, mantenere la temperatura appena al di sotto del punto di ebollizione per 10 minuti.
    2. Quindi, raffreddare le sezioni su un banco per 30 minuti. Successivamente, lavare le sezioni in PBS tre volte per 5 minuti. Asciugare accuratamente l'area intorno al campione e disegnare un grande cerchio attorno al campione usando una penna idrofoba. .
      NOTA: non toccare mai il campione. La marcatura con una penna idrofobica crea un confine idrofobo, che facilita l'uso di un volume minore di soluzione anticorpale.
    3. Spegnere l'attività della perossidasi endogena ponendo la sezione nello 0,3% H2O2 in PBS per 10 min. Sezioni di blocco con 400 μL di tampone di blocco (PBS contiene il 3% di albumina sierica bovina e lo 0,3% di detergente non ionico) per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.
    4. Lavare le sezioni in PBS per 5 min. Quindi, aggiungere 100-400 μL di anticorpo anti-CD31 diluito (1:250) sufficiente per coprire la sezione. Successivamente, incubare le sezioni durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
      NOTA: Assicurarsi che la sezione sia completamente coperta con la soluzione anticorpale.
    5. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare le sezioni tre volte in PBS per una durata di 5 minuti ciascuna.
    6. Preparare la miscela di 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) aggiungendo 1 goccia del concentrato DAB a 1 mL di diluente DAB e mescolare bene. Successivamente, aggiungere 100-400 μL di miscela DAB alle sezioni e monitorare attentamente a occhio per 2 minuti fino a quando non si osserva un'intensità di colorazione accettabile.
      NOTA: assicurarsi che la sezione sia completamente coperta con la miscela DAB.
    7. Successivamente, risciacquare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Eseguire la colorazione dell'ematossilina come descritto nei passaggi 4.4.3-4.4.5.
    8. Eseguire la colorazione eosina-Y descritta al punto 4.4.6. Eseguire le fasi di disidratazione descritte nel passaggio 4.4.7.
    9. Montato le sezioni con coverslips utilizzando il mezzo di montaggio. Usa ImageJ per stimare la percentuale di area positiva CD31 (%) in 5 campi selezionati casualmente (40x) che possono essere considerati come densità microvascolare come descritto in precedenza21.

5. Analisi statistica

  1. Utilizzare un software di analisi statistica per esprimere i risultati come media ± deviazione standard ed eseguire t -test spaiatisui confronti. Considera P < 0,05 statisticamente significativo.

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Risultati

Caratteristiche dei mouse ApoE-/-
Gli interventi chirurgici DLFA sono stati eseguiti con successo su 10 topi per stabilire il modello HLI e nessuno dei topi è morto dopo la procedura. Per seguire i cambiamenti nel peso corporeo, i topi sono stati pesati prima della procedura DLFA (Pre-DLFA) e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico DLFA (Post-DLFA). I pesi pre-DLFA variavano da 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g) e i pesi post-DLFA variavano da 26,5 a 34,1...

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Discussione

Questo studio riporta un approccio modificato, semplificato e chirurgicamente efficiente per stabilire un modello HLI nei topi ApoE-/- utilizzando la doppia legatura nelle regioni prossimale e distale della FA attraverso un'incisione di 3-4 mm senza alcun aggiornamento di laboratorio richiesto. La caratteristica principale di questo metodo è la dimensione minore dell'incisione rispetto agli studi precedentemente riportati che descrivono i modelli HLI murini8,

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che il contenuto dell'articolo è stato composto in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner per l'eccellente supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x Soluzione salina tampone fosfatoRoth9143.1Utilizzato per la colorazione di ematossilina ed eosina e per la colorazione immunoistochimica
30% H2O2Roth9681.2Utilizzato per la colorazione immunoistochimica
6-0 suture assorbibiliPROLENE8776HUtilizzato per cucire la pelle
6-0 sutura absroablePROLENEEP8706Utilizzato in chirurgia
7-0 suture assorbibiliPROLENEEH8021E Utilizzato per legare l'arteria
7-0 sutura absroablePROLENEEP8755Utilizzato in chirurgia
Acido aceticoRoth6755.1Utilizzato per colorazione di ematossilina ed eosina
Albumina Fraktion VRoth8076.2Utilizzato per colorazione immunoistochimica
AutoclaveSystec GmbHSystec VX-150Utilizzato per la sterilizzazione degli strumenti chirurgici
Microscopio Axio vert A1Carl ZeissZEISS Axio Vert.A1Utilizzato per visualizzare e scattare foto da colorazione di ematossilina ed eosina e colorazione immunoistochimica
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/AScansione dell'ostruzione dell'arteria femorale
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)Utilizzato nella gestione del dolore post-operatorio. Dose - 0,1 mg/kg di peso corporeo ogni 8 ore per 48 ore dopo l'operazione
Anticorpo CD31Abcamab28364Utilizzato per la colorazione immunoistochimica Soluzione
di eosina Y 0,5 % in acquaRothX883.1Utilizzato per la colorazione di ematossilina ed eosina
Soluzione di recupero dell'epitopo pH 6Leica Biosystems6046945Utilizzato per la colorazione immunoistochimica
Etanolo ≥ 99,5 %Roth5054.1Utilizzato per la colorazione di ematossilina ed eosina e per la colorazione immunoistochimica
FentanylCayman Chemical437-38-7Utilizzato per l'anestesia
Pinze a punta fineMedixplus93-4505SUtilizzato per separare l'arteria dal nervo e dalla vena Sterilizzatore
perle di vetroSimon KellerTipo 250Utilizzato per la sterilizzazione degli strumenti chirurgici
Graefe iris pinza curvaVUBUVUBU-02-72207Utilizzato per la separazione smussata della pelle e del tessuto sottocutaneo
Crema per la rimozione dei peli, Veet (con aloe vera)Reckitt Benckiser108972Rimuovere i peli dagli arti posteriori dei topi
Piastra riscaldanteSTÖ RK-TRONIC7042092Mantenere la temperatura massima dei topi
EmatossilinaRothT865.2Utilizzato per la colorazione di ematossilina ed eosina e per la colorazione immunoistochimica
Microscopio operatorio LeicaLeica M651Allargare il campo visivo per facilitare l'operazione
Sistema cromogeno DAB+Substrato liquidoDakoK3468Utilizzato per la colorazione
immunoistochimicaMaschio ApoE-/- topiCharles River LaboratoriesN/AUtilizzato per stabilire il modello di topi con malattia dell'arteria periferica
MedetomidinaCayman Chemical128366-50-7Utilizzato per anestesia
Micro Needle HolderBlack & Nero ChirurgicoB3B-18-8Tenendo l'ago
Micro pinza per legare la suturaLife Saver Surgical IndustriesPS-MSF-145Utilizzato per assistere nell'annodatura durante l'intervento chirurgico
MicrotomoBiobaseBk-Mt268mUtilizzato per il sezionamento tissutale
MidazolamRatiopharm44856.01.00Utilizzato per l'anestesia
Sistema di monitoraggio e gating per piccoli animali compatibile con la risonanza magnetica Modello 1025SA InstrumentsN/amonitoraggio dei segni vitali dell'animale durante la risonanza magnetica
Octeniderm farblosSchü lke & Mayr GmbH180212utilizzato per la disinfezione della pelle
Unguento per gli occhi e il nasoBayer AG1578675Mantenere gli occhi bagnati sotto anestesia
ParaformaldeideRoth0335.1Utilizzato per la fissazione del tessuto
PentobarbitalNembutal76-74-4Utilizzato per anestesia
Soluzione salinaDeltaSelect1299.99.99Utilizzato per anestesia
Forbici con manico a molla con punte fini e affilateNero & Nero ChirurgicoB66167Utilizzato per il taglio dell'arteria
SuperCut ForbiciNero & Nero chirurgicoB55992Utilizzato per il taglio della pelle
Triton X-100Roth9002-93-1Utilizzato per la colorazione immunoistochimica
Dieta occidentale, 1,25%Sniff di colesterolo Spezialdiä ten GmbHE15723-34Dieta per i topi
XyleneRoth4436.3Utilizzato per la colorazione di ematossilina ed eosina e la colorazione per immunoistochimica
a

Riferimenti

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