JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mäuse mit einem Miniaturschnitt

Published: May 13, 2021
doi:
10.3791/62402
, , , , ,
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Dieser Artikel zeigt einen effizienten chirurgischen Ansatz zur Feststellung einer akuten Ischämie bei Mäusen mit einem kleinen Schnitt. Dieser Ansatz kann von den meisten Forschungsgruppen ohne Labor-Upgrades angewendet werden.

Abstract

Ziel dieser Studie ist es, einen modifizierten chirurgischen Ansatz zur Induktion einer akuten Ischämie bei Mäusen einzuführen und zu bewerten, der in den meisten Tierlabors eingesetzt werden kann. Im Gegensatz zum herkömmlichen Ansatz für die Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) wurde ein kleinerer Schnitt an der rechten Leistenregion vorgenommen, um die proximale Oberschenkelarterie (FA) für die Durchführung von DLFA freizusetzen. Dann wurde der Schnitt mit einer 7-0-Naht in die Knieregion gezogen, um den distalen FA freizulegen. Magnetresonanztomographie (MRT) an bilateralen Hintergliedmaßen wurde verwendet, um FA-Okklusion nach der Operation zu erkennen. 0, 1, 3, 5 und 7 Tage nach der Operation wurde die funktionelle Erholung der Hintergliedmaßen visuell beurteilt und mit der Tarlov-Skala bewertet. Die histologische Untersuchung wurde nach der Einschläferung der Tiere 7 Tage nach DLFA durchgeführt. Die Eingriffe wurden bei zehnApoE-/- Mäusen erfolgreich am rechten Bein durchgeführt, und bei der anschließenden Beobachtung starben keine Mäuse. Die Schnittgrößen bei allen 10 Mäusen betrugen weniger als 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRT-Ergebnisse zeigten, dass der FA-Blutfluss auf der ischämischen Seite deutlich blockiert war. Die Ergebnisse der Tarlov-Skala zeigten, dass die Hintergliedmaßenfunktion nach dem Eingriff signifikant abnahm und sich in den folgenden 7 Tagen langsam erholte. Die histologische Untersuchung zeigte eine signifikante Entzündungsreaktion auf der ischämischen Seite und eine reduzierte mikrovaskuläre Dichte in der ischämischen Hintergliedmaße. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie eine modifizierte Technik mit einem Miniaturschnitt einführt, um eine Hintergliedmaßenischämie (HLI) unter Verwendung von DLFA durchzuführen.

Introduction

Es besteht ein ungedeckter Bedarf an präklinischen Tiermodellen für die Erforschung von Gefäßerkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (PAVK). Trotz der fortgeschrittenen Entwicklungen in Diagnose und Behandlung gab es im Jahr 2018 mehr als 200 Millionen Patienten mit PAD1, und ihre Zahl steigt ständig. Obwohl mehrere neuartige Therapieansätze2,3,4,5,6,7 beschrieben wurden, bleibt die erfolgreiche Translation dieser therapeutischen Modalitäten in die klinische Anwendung eine gewaltige Aufgabe. Daher sind zuverlässige und relevante experimentelle In-vivo-Modelle erforderlich, die den menschlichen Krankheitszustand simulieren, um den potenziellen Mechanismus und die Effizienz dieser neuen therapeutischen Ansätze zur Behandlung von PAD6zu untersuchen,7.

Hyperlipidämie und Atherosklerose (AS) sind die Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung von PAD. ApoE-/- Mäuse (auf einer fettreichen Diät) zeigen einen abnormalen Fettstoffwechsel und Hyperlipidämie und entwickeln anschließend atherosklerotische Plaques, was ApoE-/- Mäuse zur besten Wahl macht, um das klinisch relevante PAD zu simulieren. Präklinische HLI-Tiermodelle werden durch Doppelligatur der Oberschenkelarterie (DLFA) erzeugt, was der am weitesten verbreitete Ansatz in Labors auf der ganzen Welt ist8,9,10,11,12,13,14,15 zur Simulation einer akuten chronischen Ischämie. Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel einen relativ großen und invasiven Schnitt. Weiterhin führt es unweigerlich dazu, dass die Tiere (insbesondere Mäuse) unter vermehrten Schmerzverletzungen und Entzündungen leiden, was auch die nachfolgenden Experimentellen Ergebnissebeeinflusst 5,6,16,17. Diese Arbeit beschreibt ein akutes auf chronisches HLI-Modell in APOE-/- Mäusen unter Verwendung eines sehr kleinen Schnitts.

Protocol

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der EG-Richtlinie EG 2010/63/EU durchgeführt und sind durch die lokale deutsche Gesetzgebung (35-9185.81/G[1]239/18) zugelassen. Zehn männliche ApoE-/- Mäuse mit dem C57BL/6J-Hintergrund mit einem Gewicht von 29,6-38,0 g wurden in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht und mit einer westlichen Ernährung (1,25% Cholesterin und 21% Fett) und Wasser ad libitum für 12 Wochen ab dem Alter von 8 Wochen gefüttert. HLI wurde an 20 Woch…

Representative Results

Eigenschaften von ApoE-/- MäusenDLFA-Operationen wurden erfolgreich an 10 Mäusen durchgeführt, um das HLI-Modell zu etablieren, und keine der Mäuse starb nach dem Eingriff. Um Veränderungen des Körpergewichts zu verfolgen, wurden Mäuse vor dem DLFA-Verfahren (Pre-DLFA) und 7 Tage nach der DLFA-Operation (Post-DLFA) gewogen. Die Gewichte vor DLFA lagen zwischen 29,6 und 38,0 g (Mittelwert 34,74 ± 2,47 g), und die Gewichte nach DLFA lagen zwischen 2…

Discussion

Diese Studie berichtet über einen modifizierten, vereinfachten und chirurgisch effizienten Ansatz zur Etablierung eines HLI-Modells inApoE-/-Mäusen mit Doppeltligatur in den proximalen und distalen Regionen des FA durch einen 3-4 mm-Schnitt ohne erforderliche Labor-Upgrades. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die geringere Größe der Inzision im Vergleich zu zuvor berichteten Studien, die die Maus-HLI-Modelle8,9,10</sup…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Viktoria Skude, Alexander Schlund und Felix Hörner für die hervorragende technische Unterstützung.

Materials

10x Phosphate buffer saline Roth 9143.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2 Roth 9681.2 Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable sutures PROLENE 8776H Used for stitching the skin
6-0 absroable suture PROLENE EP8706 Used in Surgery
7-0 absorbable sutures PROLENE EH8021E Used for ligating the artery
7-0 absroable suture PROLENE EP8755 Used in Surgery
Acetic acid Roth 6755.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion V Roth 8076.2 Used for immunohistochemistry stain
Autoclave Systec GmbH Systec VX-150 Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscope Carl Zeiss ZEISS Axio Vert.A1 Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIII Bruker Biospin MRI GmbH N/A Scan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/ml Bayer AG 2542 (WDT) Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibody Abcam ab28364 Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in water Roth X883.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6 Leica Biosystems 6046945 Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 % Roth 5054.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Fentanyl Cayman Chemical 437-38-7 Used for anesthesia
Fine point forceps Medixplus 93-4505S Used for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisator Simon Keller Type 250 Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curved VUBU VUBU-02-72207 Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) Reckitt Benckiser 108972 Remove hair from mice hind limbs
Heating plate STÖRK-TRONIC 7042092 Keep the satble temperature of mice
Hematoxylin Roth T865.2 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscope Leica M651 Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen System Dako K3468 Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- mice Charles River Laboratories N/A Used for establish the Peripheral artery disease mice model
Medetomidine Cayman Chemical 128366-50-7 Used for anesthesia
Micro Needle Holder Black & Black Surgical B3B-18-8 Holding the needle
Micro suture tying forceps Life Saver Surgical Industries PS-MSF-145 Used to assist in knotting during surgery
Microtome Biobase Bk-Mt268m Used for tissue sectioning
Midazolam Ratiopharm 44856.01.00 Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 SA Instruments N/a monitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblos Schülke & Mayr GmbH 180212 used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and nose Bayer AG 1578675 Keep the eyes wet under the anesthesia
Paraformaldehyde Roth 0335.1 Used for fixation of the tissue
Pentobarbital Nembutal 76-74-4 Used for anesthesia
Saline DeltaSelect 1299.99.99 Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tips Black & Black Surgical B66167 Used for cutting the artery
SuperCut Scissors Black & Black Surgical B55992 Used for cutting the skin
Triton X-100 Roth 9002-93-1 Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterol ssniff Spezialdiäten GmbH E15723-34 Diet for the mice
Xylene Roth 4436.3 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
  2. Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
  3. Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
  4. Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
  5. van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
  6. Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
  7. Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
  8. Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
  9. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e1035 (2009).
  10. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  11. Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
  12. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  13. Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
  14. Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
  15. Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
  16. Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
  17. Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
  18. Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
  19. Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
  20. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  21. Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
  22. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
  23. Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
  24. Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
  25. Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
  26. Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
  27. Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
  28. Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
  29. Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
  30. Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
  31. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
  32. Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
  33. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  34. Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
  35. Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
  36. Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
  37. Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
  38. Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), 169-176 (2004).
  39. Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
  40. Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
  41. Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
  42. Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
  43. Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).

Tags

Hind Limb IschemiaApoE-/- MiceModified Surgical ModelMiniature IncisionLow InvasivenessInguinal RegionFemoral ArteryFemoral NerveFemoral VeinAbsorbable SuturesNeurovascular BundleMicrosurgical Model
check_url/it/62402?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Yan, K., Zheng, J., Zöllner, F. G., Schwenke, K., Pallavi, P., Keese, M. A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision. J. Vis. Exp. (171), e62402, doi:10.3791/62402 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image