Il protocollo presenta la trascrizione in vitro (IVT) di mRNA chimicamente modificato, la preparazione cationica dei liposomi e l'analisi funzionale delle trasfezioni di mRNA abilitate dai liposomi nelle cellule di mammifero.
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Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Il protocollo presenta la trascrizione in vitro (IVT) di mRNA chimicamente modificato, la preparazione cationica dei liposomi e l'analisi funzionale delle trasfezioni di mRNA abilitate dai liposomi nelle cellule di mammifero.
Negli ultimi anni, l'RNA messaggero chimicamente modificato (mRNA) è emerso come una potente molecola di acido nucleico per lo sviluppo di un'ampia gamma di applicazioni terapeutiche, tra cui una nuova classe di vaccini, terapie sostitutive proteiche e terapie immunitarie. Tra i vettori di consegna, le nanoparticelle lipidiche sono risultate più sicure ed efficaci nel veicolare molecole di RNA (ad esempio, siRNA, miRNA, mRNA) e alcuni prodotti sono già in uso clinico. Per dimostrare la consegna dell'mRNA mediata da nanoparticelle lipidiche, presentiamo un protocollo ottimizzato per la sintesi di mRNA funzionale di eGFP modificato con me1Ψ-UTP, la preparazione di liposomi cationici, la formazione di complessi elettrostatici di mRNA con liposomi cationici e la valutazione dell'efficienza di trasfezione nelle cellule di mammifero. I risultati dimostrano che queste modifiche hanno migliorato in modo efficiente la stabilità dell'mRNA quando somministrato con liposomi cationici e hanno aumentato l'efficienza e la stabilità della traduzione dell'mRNA eGFP nelle cellule di mammifero. Questo protocollo può essere utilizzato per sintetizzare l'mRNA desiderato e trasfettare con liposomi cationici per l'espressione genica bersaglio nelle cellule di mammifero.
Come molecola terapeutica, l'mRNA offre diversi vantaggi grazie alla sua natura non integrativa e alla sua capacità di trasfettare le cellule non mitotiche rispetto al DNA plasmidico (pDNA)1. Sebbene la consegna dell'mRNA sia stata dimostrata nei primi anni '90, le applicazioni terapeutiche erano limitate a causa della sua mancanza di stabilità, della sua mancanza di attivazione immunitaria e della scarsa efficienza traslazionale2. Modifiche chimiche identificate di recente, come la pseudouridina 5'-trifosfato (Ψ-UTP) e la metilpseudouridina 5'-trifosfato (me1Ψ-UTP) sull'mRNA, hanno cont....
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1. Produzione di mRNA modificato me1 Ψ-UTP
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Abbiamo ottimizzato il protocollo per la produzione di mRNA modificato con me1Ψ-UTP, la preparazione dei liposomi e gli esperimenti di trasfezione dell'mRNA con liposomi cationici in più cellule di mammifero (Figura 1). Per sintetizzare l'mRNA, il modello IVT eGFP ottimizzato per il codone di mammifero è stato amplificato dal vettore di espressione di mammifero mEGFP-N1 e purificato con il metodo dell'estrazione organica/precipitazione dell'etanolo (Figura 2). S.......
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Le applicazioni terapeutiche degli mRNA non modificati sono state limitate a causa della loro emivita più breve e della loro capacità di attivare le risposte immunitarie innate intracellulari, che a loro volta portano a una scarsa espressione proteica nelle cellule trasfettate11. Katalin et al. hanno dimostrato che l'RNA contenente nucleosidi modificati come m5C, m6A, ΨU e me1Ψ-UTP potrebbe evitare l'attivazione dei TLR12. Ancora più import.......
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Nessuna divulgazione
MS ringrazia il Dipartimento di Biotecnologia, India, per il sostegno finanziario (BT/PR25841/GET/119/162/2017), il Dr. Alok Srivastava, Head, CSCR, Vellore, per il suo supporto e il Dr. Sandhya, CSCR strutture principali per l'imaging e gli esperimenti FACS. Ringraziamo R. Harikrishna Reddy e Rajkumar Banerjee, Divisione di Biologia Applicata, CSIR-Indian Institute of Chemical Technology Uppal Road, Tarnaka, Hyderabad, 500 007, TS, India, per il loro aiuto nell'analisi dei dati fisico-chimici dei liposomi. Vigneshwaran V e Joshua A, CSCR per il loro aiuto nella realizzazione di video.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Lonza | 50004 | |
| Sonicatore da bagno | DNMANM Industries | USC-100 | |
| Lipidi cationici | Sintetizzato in laboratorio | ||
| Chlorofrom | MP biomedicals | 67-66-3 | "Attenzione" |
| Colesterolo | Himedia | GRM335 | |
| DEPC acqua | SRL BioLit | 66886 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| Scala del DNA | GeneDireX | DM010-R50C | |
| DOPE | TCI | D4251 | |
| EDTA sale di sodio | MP biomedicals | 194822 | |
| Etanolo | Hayman | F204325 | "Attenzione" |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270 | |
| Citometria a flusso | BD | FACS Celesta | |
| Fluroscence Microscope | Leica | MI6000B | |
| Sistema di documentazione su gel | Cell Biosciences | Flurochem E | |
| Acido acetico glaciale | Fisher Scientific | 85801 | "Attenzione" |
| mEGFP-N1, Vettore di espressione dei mammiferi | Addgene | 54767 | |
| N1-metilpseudo-UTP | Jena Bioscience | NU-890 | |
| Fenolo:cloroformio:isoamil alcol (25:24:1), pH 8.0 | SRL BioLit | 136112-00-0 | "Attenzione" |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS), pH 7.4 | CellClone | CC3041 | |
| Sonda sonicatore | Sonics Vibra Cells | VCX130 | |
| Scala RNA | NEB | N0362S | |
| Inibitore della RNasi | Thermo Scientific | N8080119 | |
| Colorante SafeView | abm | G108 | |
| Acetato di sodio | Sigma | S7545 | |
| Thermocycler Applied | biosystems | 4375786 | |
| Thermomixer | Eppendrof | 22331 | |
| Tris buffer | SRL BioLit | 71033 | |
| Tripsina | Gibco | 25200056 |
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