Heri er protokoller til indsamling og mikroinjektion af præcellulære majsplantehoppeembryoner med det formål at ændre deres genom via CRISPR/Cas9-baseret genomredigering eller til tilføjelse af markerede transponerbare elementer gennem kimlinjetransformation.
Majsplantehoppen, Peregrinus maidis, er et skadedyr af majs og en vektor af flere majsvirus. Tidligere publicerede metoder beskriver udløsningen af RNA-interferens (RNAi) i P. maidis gennem mikroinjektion af dobbeltstrengede RNA’er (dsRNA’er) i nymfer og voksne. På trods af kraften i RNAi er fænotyper genereret via denne teknik forbigående og mangler langsigtet Mendelsk arv. Derfor skal P. Maidis-værktøjskassen udvides til at omfatte funktionelle genomiske værktøjer, der vil muliggøre produktion af stabile mutantstammer og åbne døren for forskere til at anvende nye bekæmpelsesmetoder på dette økonomisk vigtige skadedyr. I modsætning til de dsRNA’er, der anvendes til RNAi, krydser de komponenter, der anvendes i CRISPR / Cas9-baseret genomredigering og kimlinjetransformation, imidlertid ikke let cellemembraner. Som følge heraf skal plasmid-DNA’er, RNA’er og / eller proteiner mikroinjiceres i embryoner, før embryoet cellulariseres, hvilket gør injektionstidspunktet til en kritisk faktor for succes. Til dette formål blev der udviklet en agarosebaseret æglægningsmetode, der gjorde det muligt at høste embryoner fra P. maidis-hunner med relativt korte intervaller. Heri gives detaljerede protokoller til indsamling og mikroinjektion af præcellulære P. maidis-embryoner med CRISPR-komponenter (Cas9-nuklease, der er blevet kompleksbundet med guide-RNA’er), og resultater af Cas9-baseret genknockout af et P. maidis øjenfarvegen, hvid, præsenteres. Selvom disse protokoller beskriver CRISPR/Cas9-genomredigering i P. maidis, kan de også bruges til at producere transgene P. maidis via kimlinjetransformation ved blot at ændre sammensætningen af injektionsopløsningen.
Majsplantehoppen, Peregrinus maidis, er et økonomisk vigtigt skadedyr af majs 1,2,3. De forårsager direkte fysisk skade på planten, både mens de fodrer med deres piercingsugende munddele, og under reproduktion, når de lægger deres embryoner direkte ind i plantevæv 2,4. På trods af de mange veje med direkte skade på afgrøder er den største indvirkning, disse insekter har på afgrødens sundhed, indirekte ved at fungere som vektor for majsmosaikvirus (MMV) og majsstribevirus 5,6. MMV er i stand til at replikere i kroppen af sin P. maidis-vektor, så virussen kan fortsætte i individuelle insekter gennem hele deres liv, så de kan fortsætte med at sprede virussen til nye værtsplanter 7,8. De mest almindelige metoder til bekæmpelse af P. maidis, og dermed de vira, det vektorer, er insekticider.
Desværre har dårlig forvaltning af disse produkter medført udvikling af resistens hos målskadegørere samt forurening af miljøet9. Derfor er der behov for nye strategier for at reducere afgrødetab fra denne kombination af insekt og virus-skadedyr. Tidligere arbejde viste, at RNA-interferens (RNAi) kunne være en effektiv kontrolmetode for P. maidis, fordi de er modtagelige for nedregulering i genekspression, selv når de indtager dobbeltstrenget RNA (dsRNA)10. Den mest effektive måde at administrere dsRNA i marken ville dog være gennem de planter, insekterne lever af; Derfor kan afgrøder stadig være modtagelige for vira, som insekterne allerede bærer. Med fremkomsten af CRISPR / Cas9-genomredigering er nye skadedyrsbekæmpelsesstrategier mulige, herunder Cas9-baseret gendrev11,12, som kan bruges til at reducere størrelsen af en skadedyrspopulation eller til at erstatte befolkningen med individer, der er resistente over for de vira, de vektor.
Udvikling og udbredelse af enhver form for gendrevsystem vil imidlertid kræve udvikling af transgene teknikker. Sådanne metoder var ikke nødvendige for at udføre RNAi-eksperimenter i P. maidis, fordi dsRNA’er og/eller siRNA’er formodes at kunne krydse cellemembraner på grund af effektiviteten af RNAi i P. maidis10,13. Dette gælder ikke for DNA og/eller proteiner, der anvendes i traditionel transgenese eller i Cas9-baseret genredigering, som begge ville være en forløber for at skabe insekter, der bærer et gendrev. For at opnå genredigering eller andre former for kimlinjetransformation mikroinjiceres disse DNA’er og proteiner ideelt i embryoner under syncytialblastoderm-stadiet, før insektembryoet cellulariseres. Timing er kritisk, fordi syncytialfasen er den tidligste del af udviklingen14,15. Da P. maidis hunner fortrinsvis lægger deres æg i plantevæv, kan ekstraktion af tilstrækkelige mængder præcellulære embryoner til mikroinjektioner være arbejdskrævende og tidskrævende. Derfor blev der udviklet nye teknikker til hurtigt at indsamle og mikroinjicere P. maidis-embryoner før cellularisering.
Æglægningskvalitet og ernæring
For nylig fik forskere, der arbejder med en beslægtet art, Nilaparvata lugens, de æg, de brugte til mikroinjektioner, direkte fra bladet og holdt de injicerede æg i bladvævet, indtil de klækkede17. Mens denne bladbaserede metode gav et mere naturligt miljø for embryonal udvikling, øgede den også chancerne for infektioner og ægskader under fjernelsesprocessen. Det kunstige ovipositionssystem, der præsenteres her, giver et mere ensartet miljø og reducerer chancerne for beskadigelse af æggene fra håndtering. Ved at sætte ovipositionskopperne op om fredagen blev størstedelen af de ovipositerede æg indsamlet i løbet af en typisk arbejdsuge til gavn for dem, der udfører mikroinjektionsarbejdet. En advarsel til denne metode er imidlertid, at manglen på næringsstoffer i 10% saccharoseopløsningsdiet i sidste ende vil påvirke insekternes sundhed, og hunner i kopperne begynder normalt at dø efter kun 10 dage. Æggekvaliteten begynder også at falde efter 6 dage, hvilket fremgår af en stigning i døde eller usunde æg. Som følge heraf er det vigtigt at være selektiv med hensyn til de æg, der anvendes til mikroinjektioner, og ikke holde hunnerne efter dag 6.
Overlevelsesrate og fugtighed
To faktorer synes at være afgørende for embryonal overlevelse gennem mikroinjektionsprocessen. Det mest udfordrende aspekt ved håndtering af P. maidis-embryoner er at forhindre dem i at tørre ud efter fjernelse fra ovipositionsmediet og gennem mikroinjektion. Da æggene typisk lægges inde i plantevæv, mangler de en passende skal for at forhindre dehydrering. Selv i den befugtede hætte gik hele sæt æg tabt på grund af udtørring. Overdreven høj luftfugtighed kan dog også påvirke mikroinjektionerne, hvis der akkumuleres vand på den dobbeltklæbende tape eller på kikkerten. Desværre var ægdehydrering normalt ikke let at bemærke under mikroinjektionsprocessen, og de syntes ofte normale indtil 2 eller 3 dage senere, da de blev helt gennemsigtige og ikke viste tegn på udvikling.
Nålekvalitet ser også ud til at spille en vigtig rolle for overlevelse. Nålen skal skrånes for at minimere unødvendig skade på ægget. Når nålen er blokeret, returneres nålen typisk til en funktionel tilstand ved hjælp af clearingfunktionen på injektoren, mens nålens spids forsigtigt stryges med en fugtig pensel (se trin 4.7). Uanset hvad anbefales det kun at putte små mængder injektionsopløsning (~ 0,25 μL) i hver nål og skifte til en ny nål hvert par dias (~ 50-60 æg) for at sikre, at nålekvaliteten opretholdes under hele injektionsprocessen.
Succesfuld generering af en knockout-fænotype
For at kunne omdanne kimcellerne skal embryomikroinjektioner normalt udføres så tidligt som muligt før cellularisering. Afhængigt af insektarten varierer tidsvinduet for at gennemføre mikroinjektionerne fra kun et par timer til så længe som en hel dag14,15,20. Det er stadig uklart, hvornår P. maidis embryoner gennemgår cellularisering. Cas9-medieret knockout blev testet på embryoner så unge som 4 timer efter æglægning (pel) til så mange som 16 timer pel, og de forventede fænotyper blev observeret i alle forsøg, hvilket tyder på, at alle mikroinjektioner blev udført inden for præcelluriseringsvinduet.
P. maidis ortologen af øjenfarvegenet, hvid, blev valgt, fordi knockout-fænotypen forventedes at være let at screene hos intravenøse på grund af dens celleautonome natur. Som forventet var både mosaik og total knockouts klart identificerbare blandt embryoner, der modtog injektionsblandingen indeholdende Cas9 og guide-RNA’er. Desværre blev ingen injektiver med fuldstændig knockout udklækket, og en masseparring af overlevende injektiver undlod at generere hvidøjede afkom. Imidlertid blev en mutant linje senere med succes genereret ved at målrette mod et andet gen (Klobasa et al., I gang). Dette tyder på, at den manglende etablering af en hvid mutantlinje sandsynligvis skyldes enten off-target-effekter (dvs. Cas9, der skærer vigtige regioner andre steder i genomet), der genererer en tæt forbundet dødelig mutation, eller til en uforudset kritisk rolle for hvid i P. maidis.
Fænotypiske og molekylære data (figur 8 og figur 9) bekræfter, at der blev skabt en signifikant knockout i det hvide locus i en prøve af injicerede embryoner, hvilket ville resultere i totalt tab af genfunktion. Desuden, mens mutationer i hvid er levedygtige i nogle arter, er der præcedens for, at reduceret hvid aktivitet er skadelig21,22. Når det er sagt, kan virkninger uden for målet ikke helt udelukkes. Forudsigelse af sandsynlige off-targets kræver nøjagtige genomsekvensdata23, hvilket den nuværende tilstand af genomiske ressourcer i P. maidis gør umuligt at gøre på nuværende tidspunkt. Uanset hvad kan testning af andre målgener med disse nye metoder udføres med tillid, endda bevæge sig mod mere traditionel transgenese i et forsøg på at bringe nye genetiske værktøjer til dette skadelige skadedyr.
The authors have nothing to disclose.
North Carolina State University, Institut for Entomologi og Plantepatologi, er en del af et team, der støtter DARPAs Insect Allies Program. De synspunkter, meninger og/eller resultater, der udtrykkes, er forfatternes og bør ikke fortolkes som udtryk for forsvarsministeriets eller den amerikanske regerings officielle synspunkter eller politikker. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. MDL, DR og AEW udtænkte projektet og sørgede for finansieringserhvervelse, projektadministration og ressourcer. FC, WK, NG og MDL udtænkte og designede mikroinjektionseksperimenterne; OH udtænkte og designede æglægningsmetoden. FC og WK udførte eksperimenterne; FC og WK analyserede resultaterne; og FC, WK, NG og MDL skrev manuskriptet. Forfatterne vil gerne rette en særlig tak til Kyle Sozanski og Victoria Barnett for deres hjælp med at opretholde P. maidis-kolonier.
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |