Summary
להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.
Abstract
צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק של תירס ווקטור של מספר נגיפי תירס. שיטות שפורסמו בעבר מתארות את הפעלת הפרעות RNA (RNAi) ב- P. maidis באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA דו-גדילי (dsRNAs) לנימפות ולמבוגרים. למרות כוחו של RNAi, פנוטיפים הנוצרים באמצעות טכניקה זו הם חולפים וחסרים תורשה מנדליאנית ארוכת טווח. לכן, יש להרחיב את ארגז הכלים של P. maidis כך שיכלול כלים גנומיים פונקציונליים שיאפשרו ייצור זנים מוטנטיים יציבים, ויפתחו את הדלת לחוקרים להביא שיטות הדברה חדשות למזיק חשוב מבחינה כלכלית זו. עם זאת, שלא כמו dsRNA המשמשים עבור RNAi, הרכיבים המשמשים בעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 וטרנספורמציה של קו הנבט אינם חוצים בקלות את קרום התא. כתוצאה מכך, דנ"א פלסמיד, רנ"א ו / או חלבונים חייבים להיות מוזרקים במיקרו לעוברים לפני שהעובר צלולריז, מה שהופך את תזמון ההזרקה לגורם קריטי להצלחה. לשם כך פותחה שיטת הטלת ביצים מבוססת אגרוז המאפשרת לקצור עוברים מנקבות P. maidis בפרקי זמן קצרים יחסית. להלן מוצגים פרוטוקולים מפורטים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי P. maidis קדם-תאיים עם רכיבי CRISPR (נוקלאז Cas9 שהורכב עם RNA מנחה), ומוצגות תוצאות של נוקאאוט גנטי מבוסס Cas9 של גן צבע עיניים P. maidis, לבן. למרות שפרוטוקולים אלה מתארים עריכת גנום CRISPR/Cas9 ב- P. maidis, הם יכולים לשמש גם לייצור P. maidis מהונדס באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט פשוט על ידי שינוי הרכב תמיסת ההזרקה.
Introduction
צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק חשוב מבחינה כלכלית של תירס 1,2,3. הם גורמים נזק פיזי ישיר לצמח, הן בעת האכלה עם איברי הפה המוצצים הנוקבים שלהם, והן במהלך הרבייה כאשר הם מטילים את עובריהם ישירות לתוך רקמת הצמח 2,4. למרות הנתיבים המרובים של נזק ישיר ליבולים, ההשפעה הגדולה ביותר שיש לחרקים אלה על בריאות היבול היא עקיפה, בכך שהם פועלים כווקטור של נגיף פסיפס תירס (MMV) ונגיף פס תירס 5,6. MMV מסוגל להשתכפל בגוף וקטור P. maidis שלו, ומאפשר לנגיף להתמיד בחרקים בודדים לאורך כל חייהם, כך שהם יכולים להמשיך להפיץ את הנגיף לצמחים מארחים חדשים 7,8. השיטות הנפוצות ביותר להדברת P. maidis, ובכך וירוסים זה וקטור, הם קוטלי חרקים.
למרבה הצער, ניהול כושל של מוצרים אלה גרם לפיתוח עמידות במזיק היעד כמו גם זיהום הסביבה9. לכן, יש צורך באסטרטגיות חדשות כדי להפחית את הפסדי היבול משילוב זה של חרקים/וירוסים-מזיקים. עבודות קודמות הראו כי הפרעות RNA (RNAi) יכולות להיות שיטת בקרה יעילה עבור P. maidis מכיוון שהם רגישים לירידה בוויסות בביטוי גנים אפילו בעת בליעת RNA דו-גדילי (dsRNA)10. עם זאת, הדרך היעילה ביותר לנהל dsRNA בשדה תהיה באמצעות הצמחים שהחרקים ניזונים מהם; לפיכך, יבולים עדיין יכולים להיות רגישים לכל וירוסים שהחרקים כבר נושאים. עם הופעת עריכת הגנום של CRISPR/Cas9, אסטרטגיות הדברה חדשות אפשריות, כולל כונן גנים מבוסס Cas911,12, שניתן להשתמש בו כדי להקטין את גודל אוכלוסיית המזיקים, או להחליף את האוכלוסייה האמורה בפרטים עמידים לנגיפים שהם וקטור.
עם זאת, פיתוח ופריסה של כל סוג של מערכת דחיפת גנים ידרוש פיתוח של טכניקות טרנסגניות. שיטות כאלה לא היו נחוצות לביצוע ניסויי RNAi ב- P. maidis מכיוון ש- dsRNA ו / או siRNA נחשבים כמסוגלים לחצות את קרום התא בשל יעילות ה- RNAi ב- P. maidis10,13. זה לא נכון לגבי הדנ"א ו/או החלבונים המשמשים בטרנסגנזה מסורתית או בעריכת גנים מבוססת Cas9, שכל אחד מהם יהיה סימן מקדים ליצירת חרקים הנושאים דחף גנטי. כדי לבצע עריכת גנים או צורות אחרות של טרנספורמציה של קו הנבט, דנ"א וחלבונים אלה מוזרקים באופן אידיאלי לעוברים בשלב הבלסטודרם הסינסיטיאלי, לפני שעובר החרק צלולריז. העיתוי הוא קריטי, מכיוון שהשלב הסינקטיאלי הוא החלק המוקדם ביותר של התפתחות14,15. מכיוון שנקבות P. maidis מעדיפות להטיל את ביציהן ברקמת הצמח, חילוץ כמויות מספיקות של עוברים קדם-תאיים למיקרו-הזרקות יכול להיות עתיר עבודה וגוזל זמן. לכן, פותחו טכניקות חדשות לאיסוף מהיר ולהזרקה זעירה של עוברי P. maidis לפני הצלולריזציה.
Protocol
1. גידול ברמת מושבה של מבוגרים P. maidis
- שתול לפחות ארבעה עציצי תירס בשבוע בכל כלוב גידול, עם 3-4 זרעים בכל עציץ. לגדול בסביבה נטולת חרקים.
- כאשר הצמחים הם ~ 5 שבועות, מניחים בתוך כלוב 30 ס"מ x 30 ס"מ x 60 ס"מ.
- השג כמות מספקת של P. maidis בוגרים (~ 500) ממעבדת מחקר או מהטבע, והכנס לכלוב חסין חרקים עם 9-12 צמחי תירס (3-4 עציצים).
- שמור על המושבה באינקובטור לגידול חרקים ב 25 ° C (± 1 ° C), עם לפחות 70% לחות ומחזור אור 14: 10.
- כדי ליצור מושבה מכויילת לגיל, הוציאו את כל הבוגרים הראשונים לאחר ארבעה ימים של הטלת ביצים, ואפשרו לעוברים המוטלים בכלוב לבקוע ולהזדקן באופן טבעי.
- העבירו חרקים בני 5 שבועות של P. maidis (בוגרים) לצמחי תירס טריים עבור תת-תרבות שבועית על-ידי איסוף עם שואף (איור 1). לאחר מכן, שחררו את הבוגרים לכלוב נקי עם צמחי תירס טריים. כדי לשמור על אספקה קבועה של צעירים למטרות ניסיוניות, הכינו כלובים טריים מכוילים לגיל מדי שבוע.
- השקו את הסירים בכלובים פעמיים ביום. יש לגזור מעת לעת גבעולים, להסיר חומר צמחי נרקב ולהחליף בעציצי תירס טריים לפי הצורך.
הערה: עם תחזוקה נאותה, מושבה יכולה להימשך ~ 5 שבועות (כלומר, מספיק זמן עבור עוברים שהונחו בכלוב כדי להפוך לבוגרים).
2. תא הטלת ביצים מבוסס אגרוז
- הכינו כלים לאיסוף ביצים (אוביפוזיציה בינונית) על ידי מזיגה של 1% עם אגרוז במים לצלחות פטרי נקיות בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ. יש לאחסן את מדיום האוביפוזיציה בטמפרטורה של 4°C לאחר שהוא מתמצק.
- הכינו תמיסת סוכרוז 10% עם V להאכלת המבוגרים. אחסנו את תמיסת הסוכרוז בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש.
- צרו תא שיחזיק את המבוגרים על-ידי חיתוך חור בתחתית של אונקיה אחת (ראו טבלת חומרים) והדבקת מסך מעל החור לצורך החלפת אוויר (איור 2).
- חותכים סרט שעוות פרפין פלסטיק לריבועים בגודל 5X5 ס"מ; מניחים בצד 2 ריבועים לכל.
- אספו ~15 נקבות בוגרות בנות שבוע ממושבת P. maidis מכויילת גיל. כדי לבחור נקבות, בחנו את הצד הגחוני של הבטן, וחפשו את האוביפוזיטור, שהוא בדרך כלל כהה יותר משאר הבטן (איור 3). החזיקו בוגרים עד שעה בבקבוקון חרוטי של 15 מ"ל אם מקימים מספר תאי הטלת ביצים. מצננים את החרקים לזמן קצר על קרח לפני הסקס ומעבירים למיכל הבוגר.
הערה: בדיקה זו יכולה להיעשות ללא מיקרוסקופ. נקבות בוגרות שהספיקו להאכיל ולהזדווג גם הן בדרך כלל בעלות בטן גדולה יותר מזכרים בוגרים והן צייתניות יותר; לפיכך, ניתן לבחור אותם בקלות רבה יותר מתוך אוכלוסיית כלובים. - העבירו את הנקבות למיכל בוגר, ואטמו את הכוס בשכבה אחת של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק על-ידי מתיחה אחידה של הכוס פי 3-4 מגודלה המקורי (איור 4A,B).
- מרחו 400 μL של תמיסת סוכרוז 10% w/v על החלק העליון של אטם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והוסיפו שכבה שנייה של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק, תוך מתיחת סרט שעוות הפרפין מפלסטיק בדיוק כפי שלמעלה (איור 4C,D).
הערה: הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק מתוח לוחץ על תמיסת הסוכרוז, שהיא חשובה מאוד להאכלה בוגרת, אך לא תמנע מהנקבות לחדור את האוביפוזיטורים שלהן כל הדרך למדיום האוביפוזיציה. - הניחו את התא הבוגר על צלחת איסוף ביצים עם צד סרט שעוות פרפין מפלסטיק ישירות על מדיום האוביפוזיציה, ועטפו את כל תא הטלת הביצים בניילון נצמד מבלי לכסות את חורי האוויר, שכן אלה נדרשים להחלפת אוויר (איור 5).
- יש לדגור על כל תא הטלת ביצים בטמפרטורה של 25°C עם 70% לחות ומחזור אור של 14:10.
- החליפו את הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק ותמיסת סוכרוז 10% עם סוכרוז מדי יום, והוציאו את כל המים שהצטברו בתוך הכוס.
3. איסוף עוברים ויישורם בסביבה עם לחות גבוהה
- הגדר מערכת מיקרו-הזרקה מבוססת סטריאומיקרוסקופ בחלל לח או מכסה מנוע (מכסה מנוע לח; איור 6) כדי להבטיח שסביבת העבודה תשיג לפחות 70% לחות לאורך כל תהליך המיקרו-הזרקה.
- בדוק את מדיום oviposition עבור ביצים לאחר תקופת הטלת הביצים הרצויה. עשו זאת במכסה מנוע לח או בסביבה לחה אחרת.
הערה: תקופת הטלת הביצים המשמשת בדרך כלל הייתה לילה, משעה 18:00 עד 10:00, ונמשכה ~ 16 שעות. - אם ביצים מוטלות באגרוז, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לחפור אותן בזהירות, והניחו אותן על פני השטח של האגרוז כדי לשמור עליהן לחות (איור 7A).
- החל רצועה של סרט דו-צדדי בגודל 1 מ"מ x 15 מ"מ על כיסוי בגודל 22 מ"מ x 30 מ"מ (איור 7B). הניחו את סרט הכיסוי כלפי מעלה על מדיום האוביפוזיציה (איור 7C).
- הרימו כל ביצה בנפרד ממשטח האגר, ועברו לסרט הדו-צדדי בעזרת מברשת עדינה. הסר את כל הביצים כי הם לבנים לחלוטין או יש צבע שחור עליהם. ביצים בריאות יהיו שקופות למחצה.
- הניחו את הביצים בצורת בננה על צידן, כשהקצה הגדול יותר תקוע על הסרט הדו-צדדי (איור 7D).
הערה: יש לשמור תמיד את הביצים בסביבה עם לחות גבוהה, כגון צלחת פטרי יצוקה עם שכבה של 1% אגר בתחתית.
4. הכנת ריאגנטים CRISPR ומחטי הזרקה
- משוך מחטי קוורץ באמצעות מושך מיקרופיפטה מסוג Flaming/Brown.
- משופעים את מחטי הקוורץ באמצעות שיפוע מיקרופיפטה.
- השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי לאבטח מחטים שנמשכו במיכל שקוף, כגון צלחת פטרי, עד שהן מוכנות לשימוש.
- הכן את תמיסת ההזרקה על ידי שילוב של 0.5 μL של חלבון Cas9 (תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/μL) ו-0.5 μL של sgRNA (תמיסת מלאי של 4 מיקרוגרם/μL; ראה טבלת חומרים) עם 1 μL של חיץ אדום פנול בנפח סופי של 5 μL. כדי לזרז חלקיקים שעלולים לסתום את המחט, מערבלים את התמיסה לזמן קצר, וצנטריפוגה למשך 3 דקות במהירות מרבית.
- ממלאים את מחט ההזרקה, דואגים להשאיר את תערובת ההזרקה ליד הקצה המחודד של המחט. הסר בועות, אם בכלל, מקצה המחט.
- הניחו בזהירות את המחט הממולאת לאחור במחזיק המחט, והדקו את צווארון הנירוסטה כדי להחזיק את המחט בבטחה במקומה במהלך מיקרו-הזרקה.
- צור זרימה אמינה של תמיסת הזרקה מהמחט על ידי ליטוף עדין של הקצה המשופע עם מברשת צבע עדינה ולחה, תוך העברת פרצי לחץ אוויר למחט באמצעות מערכת ההזרקה.
הערה: המחט מוכנה להזרקה כאשר תערובת ההזרקה יכולה לעזוב את הקצה בכמויות קטנות.
5. מיקרו-הזרקה וטיפול לאחר הזרקה
- הכינו משטח מיקרו-הזרקה על ידי מילוי צלחת פטרי נקייה בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ באגר 1% ליצירת שכבה שטוחה של אגר עם החלק העליון של המנה.
- הניחו על מצע האגר פתק שהוכן מראש עם ~25 עוברים (איור 8A).
הערה: כל שלבי ההזרקה חייבים להתבצע בתוך מכסה מנוע לח (~ 70% לחות). - בדוק את לחץ ההזרקה על ידי הנחת קצה המחט בטיפת מים והתחלת מחזור ההזרקה.
הערה: כמות קטנה של תמיסת הזרקה אמורה להתפזר לתוך המים אם הגדרת הלחץ נכונה (איור 8B). - הכניסו את המחט לקצה הגדול יותר של העובר, כשהיא מתקרבת מצד שמאל של המכסה (איור 8C). העבירו את תמיסת ההזרקה לתוך הביצית, ושלפו את המחט במהירות.
- לאחר הזרקת כל הביצים, הניחו את הכיסוי על פני צלחת אגר חדשה 1%, והעבירו את התבשיל לתא לחות (איור 9).
6. דגירה ובקיעה של עוברים
- שים את תא הבקיעה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך 6 ימים.
- העבירו את כל העוברים ששרדו, בעזרת מים נקיים ומברשת עדינה, לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ עם נייר פילטר לח במים המכסה את תחתית המנה. אטמו את צלחת הפטרי עם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והחזיקו בטמפרטורה של 25°C כדי לאפשר לעוברים לבקוע. התחל לבדוק את העוברים 6 ימים לאחר ההזרקה להישרדות.
הערה: נימפות אינסטאר ראשונות יתחילו לבקוע בסביבות היום השמיני. - מעבירים נימפות, בעזרת מברשת עדינה, לצלחת פטרי המכילה גזירי עלים. מכסים את המנה, ואוטמים בסרט שעוות פרפין מפלסטיק.
- לדגור על צלחת אטומה של אבקועים על ייחורי עלים במשך 48 שעות ב 25 ° C.
- העבירו את כל הנימפות בנות היומיים מסבב זריקות לכלוב גידול עם צמחי תירס באמצעות מברשת עדינה. אם מזריקים עם פנוטיפ נראה לעין מתאוששים במספרים מספיקים, החזירו אותם בנפרד כדי למקסם את ההתאוששות של תכונת המטרה בדור הבא. אחרת, לבצע הזדווגות המונית של כל הזריקים.
הערה: הניחו את האבקועים בעדינות במערבולת של צמח התירס כדי לספק מקלט ולהבטיח לחות נאותה של סביבתם הקרובה. - לגדל את החרקים בתנאים שתוארו לעיל, תוך הבטחת טמפרטורה נאותה, לחות, והעברות קבועות לצמחי תירס טריים.
- צאצאי מסך לפנוטיפים צפויים. הכניסו אנשים המציגים את הפנוטיפ הרצוי לכלוב משלהם כדי ליצור קווים הומוזיגוטיים.
Representative Results
תא הטלת הביצים תוכנן במיוחד כדי לאפשר לנקבות P. maidis להיזון תוך כדי אוביפוזיטציה בתווך מגן שממנו ניתן היה לשחזר את ביציהן בקלות. באמצעות שיטה זו, כמויות מספיקות של עוברים קדם-תאיים נמצאו לצורך מיקרו-הזרקה עם DNA, RNA ו/או חלבונים. נקבות P. maidis בוגרות בדרך כלל מטילות ביצים בתוך רקמת העלים של צמחי התירס, מה שהופך את קבלת מספיק ביצים בזמן קצר לאתגר מכיוון שזה דורש הרבה דיסקציה של עלים. סביבת ההטלה המלאכותית מספקת פתרון להתגברות על בעיות אלו. כפי שניתן לראות בטבלה 1, 6,483 ביצים נאספו מ-645 נקבות בתוך 4 שבועות. הנקבות בדרך כלל מתחילות להטיל ביצים לאחר היום השני ומספקות את רוב הביצים מהיום הרביעי עד היום השישי. פעילות האוביפוזיציה הואטה ביום ה-9. כל תא ביצות הוקם ביום שישי ובדק ביצים מיום ראשון עד יום ראשון הבא. מעקב אחר לוח זמנים זה איפשר לאסוף את רוב הביציות למיקרו-זריקות במהלך שבוע העבודה.
היישום המעשי הראשון של מערכת הטלת ביצים זו היה לבחון את היעילות של נוקאאוט גנטי בתיווך Cas9, תוך שימוש באורתולוג P. maidis של הגן בצבע עיניים, לבן (Pmw), כמטרה. מוטציות בלבן ידועות כגורמות לאובדן משמעותי של פיגמנטציה בעין במינים אחרים של חרקים, ולבן הוא אוטונומי תאי, המאפשר גילוי מוטציות בפרטים מוזרקים16,17. כדי להגדיל את הסיכוי שאפילו מוטציה קטנה תגרום לאובדן תפקוד, RNA מנחה תוכנן לחתוך בתוך האזור של קלטת קשירת ATP, אשר הכרחי עבור פונקציה לבנה16. לעוברי P. maidis הוזרקו 20% פנול אדום (חיץ הזרקה), חיץ הזרקה עם Cas9 בריכוז סופי של 800 ng/μL (בקרת Cas9), או Cas9 בחיץ הזרקה יחד עם שלושה RNA מנחים שנוספו בריכוז של 400 ng/μL כל אחד. השילוב של שלושה מדריכים בתמהיל הזרקה אחד נועד למקסם עוד יותר את הסיכויים ליצירת מוטנטים, הן על ידי יצירת מחיקה גדולה, והן על ידי פיצוי על האפשרות שמדריך אחד לא יהיה יעיל לחיתוך. שיעורי ההתפתחות בכל טיפול היו דומים (טבלה 2), כאשר 50-60% מהמוזרקים הראו סימני התפתחות. שיעורי הצוהר עבור פקדי החיץ וה-Cas9 היו דומים אף הם; עם זאת, שיעורי הבקיעה של פרטים שקיבלו את תערובת שלושת המדריכים היו נמוכים יחסית. בשלב זה, לא ברור אם ההישרדות המופחתת היא תוצאה של אובדן התפקוד הלבן או תוצאה של תוצאות לא מכוונות של תמהיל שלושת המנחים, כגון השפעות מחוץ למטרה (ראה פרק הדיון). עם זאת, אף אחד מהאנשים עם אובדן מוחלט של פיגמנטציה בעין (כלומר, נוקאאוט מוחלט) לא בקע, ואף אחד מצאצאי האנשים שהוזרקו לא היה בעל עיניים לבנות. היעילות הממוקדת של מוטגנזה מבוססת Cas9 אומתה בשתי דרכים. ראשית, המזרקים נבדקו לאיתור אובדן פיגמנטציה בעין.
מתוך 71 פרטים שהתפתחו בהזרקת הנחיה, 23 הראו מידה מסוימת של אובדן פיגמנט (איור 10), ו-9 מהפרטים האלה בקעו, מה שהביא לשיעור נוקאאוט של ≥32%. לא נצפה אובדן פיגמנט בעין בשני טיפולי הביקורת. שנית, מוטציות כרומוזומליות אושרו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)18 וריצוף19. מכיוון שלא ניתן היה לשחזר קו מוטנטי, דנ"א גנומי נותח ממאגרים של עוברים שהוזרקו להם תערובת שלושת המנחים או חיץ. תערובת שלושת המדריכים צפויה להסיר ~180 זוגות בסיסים מהלוקוס הלבן . ניתן לראות זאת בתוצרי PCR המוגברים מדנ"א גנומי שבודד מאנשים מוזרקים, כמו גם בנתוני הרצף הקשורים המופקים מאותם מוצרים (איור 11). ראיות משולבות אלה מצביעות על כך שהעוברים הוזרקו לפני שהתרחשה הצלולריזציה.
איור 1: שואף. ניתן להרכיב שואב יעיל החל מחיבור משאבת ואקום בכניסה, באמצעות צינורות פלסטיק, ועד לצינור חרוטי פלסטיק בנפח 15 מ"ל. כ 0.5 ס"מ יש להסיר בזהירות מתחתית הצינור החרוט. כדור צמר גפן צריך להיות ממוקם בתוך צינור חרוט, מעל הפתח של צינורות פלסטיק, כדי לתפוס מבוגרים P. maidis כפי שהם נאספים ולשמור אותם מחוץ משאבת ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בניית מכולות בוגרות. (A) האספקה הדרושה (בכיוון השעון משמאל למעלה): מסך, אקדח דבק חם, סכין גילוח, מכל של אונקיה אחת. (B) יש לחתוך חור גדול בתחתית המיכל במשקל 1 אונקיות, ולחתוך ריבוע מסך גדול מספיק כדי לכסות את החור הזה. (C) לאחר מכן מדביקים את המסך מעל החור באמצעות דבק חם. (D) לאחר הגדרת הדבק, יש להסיר את עודפי הרשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: Sexing P. maidis מבוגרים. הצדדים הגחונים של זכר (שמאל) ונקבה (ימין) P. maidis בוגרים מוצגים. האוביפוזיטור, הנראה מעל הבטן הנשית, הוא האינדיקטור הברור ביותר למינו של אדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: איטום מבוגרים למכלים . (A) ריבוע של 5X5 ס"מ מפלסטיק של שעוות פרפין. (B) יש למתוח את היריעה באופן שווה עד פי 3-4 מגודלה המקורי. (C) לאחר הכנסת המבוגרים למיכל המבוגרים, יש להניח את הסרט המתוח מעל הפתח כדי לאבטח את המבוגרים. לאחר מכן יש להניח טיפה של 400 μL של תמיסת סוכרוז של 10% w/v על גבי היריעה. (D) כדי לספק לחץ הזנה הולם למבוגרים, יש למתוח באופן דומה ריבוע נוסף בגודל 5 ס"מ x 5 ס"מ של סרט פרפין מפלסטיק ולהניח אותו מעל טיפת סוכרוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרת תא אוביפוזיציה. (A) האספקה הדרושה (בכיוון השעון משמאל למעלה): ניילון נצמד, מיכל שלם למבוגרים (עם מבוגרים), וצלוחית פטרי עם 1% אגרוז (מדיום אוביפוזיציה). (B) יש להניח את המיכל הבוגר על האגרוז עם סרט פרפין מפלסטיק/'סנדוויץ' סוכרוז 10% המונח' ישירות על מדיום האוביפוזיציה. (C) ניילון נצמד משמש להצמדת המיכל הבוגר למדיום האוביפוזיציה. זה שומר על המדיום מלהתייבש מהר מדי. (ד) יש להקפיד להימנע מכיסוי המסך של המיכל הבוגר, כך שתחלופת האוויר עדיין עשויה להימשך. (E) תרשים של תא האוביפוזיציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מכסה מנוע לח. מכסה מנוע המצויד במכשיר אדים הוצב סביב היקף ההזרקה כדי למזער את טיוטות האוויר ולשמור על לחות בזמן הטיפול בעוברים. ניתן לקפל דשים מעל הכניסה לאחר שהעובד נמצא במקומו, כדי לסייע בשמירה על רמות לחות נאותות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: איסוף עוברים לקראת זריקות . (A) עוברים שהופקדו בתווך הביציות. זוג מלקחיים עדינים משמשים לחילוץ עוברים מהמדיום והנחתם על פניו. (B) רצועה צרה של סרט דו-צדדי בגודל 1 מ"מ x 15 מ"מ על גבי כיסוי בגודל 22 מ"מ x 30 מ"מ. (ג) ניתן להניח את תלוש הכיסוי על מדיום האוביפוזיציה כדי להקל על העברת עוברים מפני השטח של התווך אל סרט הדבק שעל הכיסוי. (D) עוברי P. maidis הם בצורת בננה, כאשר קצה אחד צר יותר מהשני (קצה צר מסומן בראש חץ אדום; קצה רחב יותר מסומן בראש חץ צהוב בעובר לדוגמה). הקצה הרחב של העובר צריך להיות ממוקם על הקלטת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: הזרקה. (A) משטח ההזרקה הוא צלחת פטרי מלאה עד גדותיה באגר 1%. יש להניח את הכיסוי עם רצועת סרט המחזיק עוברים ישירות על פני משטח פלטפורמת ההזרקה. (B) יש לבדוק את לחץ ההזרקה לפני הזרקת עוברים על ידי "הזרקת" כמות קטנה של תמיסת הזרקה לטיפת מים. שיטה זו יכולה לשמש גם בכל עת במהלך תהליך ההזרקה כדי לבדוק את המחט עבור סתימות. (C) יש להזריק עוברים על-ידי החדרת המחט לקצה הגדול יותר של העובר. פתרון ההזרקה צריך להיות גלוי אם ההזרקה היתה מוצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: טיפול לאחר הזרקה . (A) לאחר הזרקת כל העוברים שעל תלוש הכיסוי, יש להניח את הכיסוי בכלי פטרי טרי המכיל 1% אגרוז. (B) צלחת הפטרי עם הכיסוי יכולה להישמר בתא לחות (כמו זה המוצג) עד שהעוברים בוקעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: פנוטיפ נוקאאוט של PMW . (A) קבוצת ביקורת תואמת גיל ו-(B) עוברי נוקאאוט של Pmw , עם עיניים מתפתחות המסומנות על ידי ראשי חץ שחורים. העובר ב-B הוא פסיפס, שכן ניתן לראות פס קטן של פיגמנטציה. (C) בקרה תואמת גיל ו-(D) אבקועי נוקאאוט של Pmw , עם כניסות המראות זווית שונה על העיניים. גם האבקוע ב-D הוא פסיפס. חץ לבן מצביע על אזור בתמונה הראשית המציג אובדן פיגמנטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: רצף נוקאאוט של PMW . (A) מודל בקנה מידה של Pmw mRNA, המסומן במרווחים של 500 bp, עם מיקומים של אתרי קישור gRNA מסומנים: G1, כחול; G2, צהוב; G3, ורוד. כל מוטציה של שינוי מסגרת שתיווצר בשלב זה תשבש את רוב תוצר התרגום. (B) הקשר גנומי של אתרי gRNA, כולם באקסון אחד (טקסט מודגש באותיות רישיות). אתרי איגוד קווי עזר מסומנים באותם צבעים כמו A, ורכיבי PAM מסומנים בקו תחתון. טווח הוא ~ 300 bp. התרגום בתוך מסגרת של האקסון מוצג לעיל, כקיצורים של אות אחת בטקסט ריש. מסומנים שני מוטיבים ספציפיים למובילי פיגמנטים בעין. מוטיב CDEPT של התחום הפונקציונלי Walker B מסומן בארגמן, ומוטיב IHQP של תחום H-loop מסומן בירוק. שני התחומים קריטיים לתפקוד טרנספורטר ATP. (C) אזור היעד של מבט לתקשורת פלסטינית הוגבר באמצעות שני סבבי PCR. המוצר בסבב השני נבדק על גבי ג'ל לעדות לשינוי גודל עקב הסרה מוצלחת של האזור בין המדריכים. נתיבים: L = 100 bp סולם; 1 = בקרת מים PCR; 2 = ביצים מוזרקות חיץ; 3-4 = שתי קבוצות נפרדות של ביצים המוזרקות בתערובת תלת מדריכה. רק עוברים שקיבלו את תערובת שלושת המנחים הפיקו הן את רצועת WT (חץ אדום) והן את הרצועה כתוצאה מכריתה מלאה (חץ לבן). (D) כדי לאשר את זהותה של הרצועה התחתונה (חץ לבן), דנ"א זה טוהר, שוכפל ורוצף. הקו העליון הוא הרצף הפראי. שני הקווים האחרים הם רצפים משני שיבוטים. שלושה שיבוטים נוספים התאימו לרצף התחתון. סימון כחול מציין את אתר הכריכה של מדריך 1, ואילו סימון ורוד מציין את אתר הכריכה של מדריך 3. בשני האללים נמחק כל האזור שבין שני אתרי ההדרכה הללו. קיצורים: Pmw = הגן הלבן Peregrinus maidis ; gRNA = רנ"א מנחה; PAM = מוטיב סמוך פרוטוספייסר; ATP = אדנוזין טריפוספט; PCR = תגובת שרשרת פולימראז; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| הצית | # של כוסות | # של נקבות בכל | # של ביצים | סה"כ # של ביצים | |||||||
| יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 5 | יום 6 | יום 7 | יום 8 | יום 9 | ||||
| 1 | 10 | 15 | 0 | 26 | 166 | 355 | 530 | 193 | 91 | 37 | 1398 |
| 2 | 15 | 15 | 22 | 238 | 489 | 699 | 520 | 379 | 203 | 58 | 2608 |
| 3 | 8 | 15 | 0 | 57 | 230 | 190 | 116 | 80 | 34 | 1 | 708 |
| 4 | 10 | 15 | 0 | 226 | 446 | 519 | 301 | 179 | 24 | 15 | 1710 |
| סך | 43 | 15 | 23 | 547 | 1331 | 1763 | 1467 | 831 | 352 | 111 | 6483 |
טבלה 1: אוספי ביצים מייצגים מסביבת ביצית מלאכותית. נתונים מארבעה סטים של כוסות איסוף ביצים מוצגים, כאשר טליות הביצים מתחילות ביום השני לאחר ההתקנה ונמשכות עד היום התשיעי.
| טיפול בהזרקה | סה"כ הזרקה | סה"כ פותח | סה"כ בקע | קצב פיתוח (%) | שיעור בקיעה (%) |
| מאגר | 39 | 20 | 12 | 51 | 31 |
| צרפת | 39 | 24 | 14 | 61 | 36 |
| Cas9 +Pmw gRNA | 121 | 71 | 28 | 59 | 28 |
טבלה2: שיעורי הישרדות ונוקאאוט מזריקות של 3 תערובות הזרקה שונות.
Discussion
איכות ותזונה של הטלת ביצים
לאחרונה, חוקרים שעבדו עם מין קרוב, Nilaparvata lugens, השיגו את הביצים שבהן השתמשו למיקרו-הזרקות ישירות מהעלה, ושמרו את הביצים המוזרקות ברקמת העלה עד שבקעו17. בעוד שיטה מבוססת עלים זו סיפקה סביבה טבעית יותר להתפתחות עוברית, היא גם הגדילה את הסיכויים לזיהומים ולנזק לביציות במהלך תהליך ההסרה. מערכת האוביפוזיציה המלאכותית המוצגת כאן מספקת סביבה אחידה יותר ומפחיתה את הסיכוי לנזק לביצים מהטיפול. על ידי הצבת כוסות האוביפוזיט ביום שישי, רוב הביצים שנאספו במהלך שבוע עבודה טיפוסי, לטובת אלה שביצעו את עבודת המיקרו-הזרקה. אזהרה אחת לשיטה זו, עם זאת, היא כי חוסר חומרים מזינים בתזונה 10% תמיסת סוכרוז ישפיע בסופו של דבר על בריאותם של החרקים, והנקבות בכוסות בדרך כלל מתחילות למות לאחר 10 ימים בלבד. גם איכות הביצים מתחילה לרדת לאחר 6 ימים, כפי שמעידה עלייה בביצים מתות או לא בריאות למראה. כתוצאה מכך, חשוב להיות סלקטיביים של הביצים המשמשות microinjections ולא לשמור על הנקבות לאחר יום 6.
שיעור הישרדות ולחות
נראה כי שני גורמים הם קריטיים להישרדות העובר באמצעות תהליך המיקרו-הזרקה. ההיבט המאתגר ביותר בטיפול בעוברי P. maidis הוא שמירה עליהם מפני התייבשות לאחר הסרתם ממדיום האוביפוזיציה ולאורך מיקרו-הזרקה. מכיוון שהביצים מוטלות בדרך כלל בתוך רקמת הצמח, חסרה להן קליפה מספקת למניעת התייבשות. אפילו במכסה המנוע הלח אבדו סטים שלמים של ביצים בגלל התייבשות. עם זאת, לחות גבוהה מדי עלולה להשפיע גם על המיקרו-הזרקות אם הצטברו מים על הסרט הדו-צדדי או על ההיקף. למרבה הצער, בדרך כלל לא היה קל להבחין בהתייבשות ביצים במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, ולעתים קרובות הן נראו נורמליות עד יומיים או שלושה לאחר מכן, כאשר הן הפכו שקופות לחלוטין, ולא הראו סימני התפתחות.
נראה כי גם איכות המחטים משחקת תפקיד חשוב בהישרדות. המחט צריכה להיות משופעת כדי למזער נזק מיותר לביצה. כאשר המחט חסומה, שימוש בפונקציית הניקוי על המזרק תוך ליטוף עדין של קצה המחט עם מברשת צבע רטובה (ראה שלב 4.7) בדרך כלל מחזיר את המחט למצב תפקודי. בכל מקרה, מומלץ להכניס רק כמויות זעירות של תמיסת הזרקה (~0.25 μL) לכל מחט ולעבור למחט חדשה כל כמה שקופיות (~ 50-60 ביציות) כדי להבטיח שמירה על איכות המחט לאורך כל תהליך ההזרקה.
דור מוצלח של פנוטיפ נוקאאוט
כדי להפוך בהצלחה את תאי הנבט, מיקרו-זריקות עובר בדרך כלל צריך להיעשות מוקדם ככל האפשר לפני צלולריזציה. בהתאם למיני החרקים, חלון הזמן להשלמת המיקרו-הזרקות נע בין כמה שעות בלבד ליום שלם14,15,20. עדיין לא ברור מתי עוברים עוברי P. maidis בצלולריזציה. נוקאאוט בתיווך Cas9 נבדק על עוברים בני 4 שעות לאחר הטלת ביצים (pel) עד 16 שעות pel, והפנוטיפים הצפויים נצפו בכל הניסויים, מה שמרמז על כך שכל המיקרו-הזרקות בוצעו בחלון הפרה-צלוריזציה.
אורתוטיפ P. maidis של הגן בצבע עיניים, לבן, נבחר מכיוון שפנוטיפ הנוקאאוט היה צפוי להיות קל לסינון בהזרקות בשל אופיו האוטונומי התא. ואכן, כצפוי, הן פסיפס והן נוקאאוט מוחלט היו ניתנים לזיהוי בבירור בקרב עוברים שקיבלו את תערובת ההזרקה המכילה Cas9 ורנ"א מנחה. למרבה הצער, לא בקעו מזריקים עם נוקאאוט מוחלט, והזדווגות המונית של מזריקים ששרדו לא הצליחה ליצור צאצאים לבני-עיניים. עם זאת, קו מוטנטי נוצר מאוחר יותר בהצלחה על ידי התמקדות בגן אחר (Klobasa et al., בתהליך). זה עשוי להצביע על כך שהכישלון לבסס קו מוטנטי לבן נובע ככל הנראה מהשפעות מחוץ למטרה (כלומר, Cas9 חותך אזורים חשובים במקומות אחרים בגנום) המייצרות מוטציה קטלנית הקשורה קשר הדוק, או מתפקיד קריטי בלתי צפוי עבור לבן ב- P. maidis.
נתונים פנוטיפיים ומולקולריים (איור 8 ואיור 9) מאשרים כי נוצר נוקאאוט משמעותי בלוקוס הלבן בדגימה של עוברים מוזרקים, מה שיגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. יתר על כן, בעוד מוטציות בלבן הן בנות קיימא במינים מסוימים, יש תקדים לכך שפעילות לבנה מופחתת מזיקה21,22. עם זאת, לא ניתן לשלול לחלוטין השפעות מחוץ למטרה. חיזוי סביר של מטרות מחוץ למטרות דורש נתוני רצף גנום מדויקים23, מה שהמצב הנוכחי של המשאבים הגנומיים ב- P. maidis אינו מאפשר לבצע בשלב זה. בכל מקרה, עם שיטות חדשות אלה, בדיקת גני מטרה אחרים יכולה להיעשות בביטחון, אפילו לנוע לעבר טרנסגנזה מסורתית יותר במאמץ להביא כלים גנטיים חדשים למזיק מזיק זה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אוניברסיטת צפון קרוליינה, המחלקה לאנטומולוגיה ופתולוגיה של צמחים, היא חלק מצוות התומך בתוכנית בעלי הברית של החרקים של DARPA. הדעות, הדעות ו/או הממצאים המובעים הם של המחברים ואין לפרש אותם כמייצגים את ההשקפות או המדיניות הרשמיות של משרד ההגנה או ממשלת ארה"ב. המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים. MDL, DR ו-AEW הגו את הפרויקט וסיפקו מימון, רכישה, ניהול פרויקטים ומשאבים. FC, WK, NG ו-MDL הגו ועיצבו את ניסויי המיקרו-הזרקה; OH הגה ועיצב את שיטת הטלת הביצים. FC ו-WK ביצעו את הניסויים; FC ו-WK ניתחו את התוצאות; ו-FC, WK, NG ו-MDL כתבו את כתב היד. המחברים רוצים להודות במיוחד לקייל סוזנסקי וויקטוריה ברנט על עזרתם בשמירה על מושבות פ. מיידיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
| 15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
| Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
| Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
| Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
| Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
| Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
| Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
| Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
| Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
| Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
| Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
| Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
| General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
| Guide RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
| Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
| Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
| Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
| Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
| Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
| Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
| Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
| Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
| Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
| pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
| Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
| Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
| Primer - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Primer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
| Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |
References
- Namba, R., Higa, S. Y. Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii. Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).
- Singh, B. U., Seetharama, N. Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems. Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).
- Tsai, J. Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis. Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).
- Chelliah, S., Basheer, M. Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum. Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).
- Lastra, J., Esparza, J. Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus. Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).
- Nault, L. R., Ammar, E. -D. Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses. Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).
- Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 14 (2016).
- Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae). Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).
- Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper. PloS One. 8 (8), 70243 (2013).
- Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 3, 03401 (2014).
- Gantz, V. M., Bier, E. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector. Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).
- Kimelman, D., Martin, B. L. Anterior-posterior patterning in early development: three strategies. Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).
- Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm. Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).
- Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes. Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).
- Xue, W. H., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998 (2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).
- Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497 (2018).
- Brent, C. S., Hull, J. J. RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527 (2019).
- Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
