Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen
Summary
Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.
Abstract
Nitrationen (NO3-) galten früher als inerte Endprodukte des Stickstoffmonoxid (NO)-Stoffwechsels. Frühere Studien zeigten jedoch, dass Nitrationen bei Säugetieren durch einen zweistufigen Reduktionsmechanismus wieder in NO umgewandelt werden können: Nitrat wird hauptsächlich von oralen kommensalen Bakterien zu Nitrit (NO2-) reduziert, dann wird Nitrit durch verschiedene Mechanismen, einschließlich über Häm- oder Molybdän-haltige Proteine, zu NO reduziert. Dieser reduktive Nitratweg trägt zur Verbesserung der NO-vermittelten Signalwege bei, insbesondere im Herz-Kreislauf-System und bei Muskeltraining. Der Nitratgehalt im Körper vor einer solchen Verwertung wird durch zwei verschiedene Quellen bestimmt: endogene NO-Oxidation und Nitrataufnahme über die Nahrung, hauptsächlich aus Pflanzen. Um den komplexen NO-Zyklus unter physiologischen Bedingungen aufzuklären, haben wir die Dynamik seiner Metaboliten, Nitrat- und Nitritionen, die im Vergleich zu NO relativ stabil sind, weiter untersucht. In früheren Studien wurde die Skelettmuskulatur als Hauptspeicherorgan für Nitrationen bei Säugetieren sowie als direkte Quelle von NO während des Trainings identifiziert. Daher ist die Etablierung einer zuverlässigen Methodik zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in der Skelettmuskulatur wichtig und sollte hilfreich sein, um ihre Anwendung auf andere Gewebeproben auszudehnen. Dieser Artikel erläutert ausführlich die Vorbereitung von Skelettmuskelproben mit drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden für Nitrat- und Nitritmessungen und diskutiert wichtige Fragen im Zusammenhang mit Homogenisierungsprozessen, einschließlich der Größe der Proben. Nitrat- und Nitritkonzentrationen wurden auch über vier verschiedene Muskelgruppen hinweg verglichen.
Introduction
Stickstoffmonoxid (NO), ein kleines gasförmiges Signalmolekül, spielt eine entscheidende Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen1. NO kann aus L-Arginin durch endogene Enzyme der Familie der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) hergestellt werden, bevor es einer schnellen Oxidation zu Nitrat (NO3-) und möglicherweise Nitrit (NO2-) in Blut und Geweben 2,3 unterzogen wird. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Anionen in Säugetiersystemen wieder zu NO reduziert werden4. Nitrat wird in Nitrit umgewandelt, hauptsächlich durch kommensale bakterielle Nitratreduktasen in der Mundhöhle, die auf Ionen wirken, die von den Speicheldrüsen abgesondert und direkt aufgenommen werden 5, und in gewissem Maße durch Säugetierenzyme wie Xanthinoxidoreduktase 6,7. Nitrit kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Desoxyhämoglobin8, Desoxymyoglobin9, molybdänhaltige Enzyme 10 und nicht-enzymatische Reduktion in Gegenwart von Protonen11,12, weiter zu NO reduziert werden.
Dieser Nitrat-Nitrit-NO-Weg wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt, wobei die NOS-Aktivität verringert wird, da NOS Sauerstoff für die NO-Erzeugung4 benötigt. Viele neuere Studien haben positive Auswirkungen von diätetischem Nitrat auf die Blutdruckregulierung und die Trainingsleistung berichtet, was darauf hindeutet, dass Nitratreduktionswege zur Verstärkung der NO-Signalisierung beitragen13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass einige Skelettmuskeln wahrscheinlich die wichtigsten Nitratspeicher im Körper sind16. Im Vergleich zu Blut oder anderen inneren Organen wie Leber enthält die Skelettmuskulatur (Gluteus maximus) deutlich höhere Nitratwerte und hat eine erhebliche Masse im Säugetierkörper. Es wurde gezeigt, dass Laufbandübungen die Nitratreduktion zu Nitrit und zu NO im Gesäß in einem Rattenmodell7 verstärken. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige Skelettmuskeln wichtige Quellen für NO durch Nitratreduktionswege in physiologischen Situationen sein könnten. Neuere Studien deuten darauf hin, dass diese Ergebnisse, einschließlich Veränderungen des Muskelnitratspiegels während des Trainings, auch beim Menschen auftreten17.
Zwei der aktuellen Autoren hatten zuvor eine Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Blut und anderen flüssigen Proben etabliert18. Als jedoch die Konzentrationen dieser Anionen in Gewebehomogenaten zunächst analysiert wurden, waren detaillierte Protokolle nicht verfügbar. Um die Nitrat-Nitrit-NO-Dynamik in verschiedenen Organen zu verstehen, war es unser Ziel, eine genaue und effiziente Methode zur Messung des Nitrat- und Nitritspiegels in Säugetiergeweben einschließlich der Skelettmuskulatur zu entwickeln. In früheren Studien wurden Nagetiergewebe verwendet, um zuverlässige Homogenisierungsprozesse zu entwickeln und dann den Nitrat- und Nitritgehalt in den Homogenaten 7,16,19 zu analysieren. Die Verwendung dieser Homogenisierungsmethode wurde auf menschliche Skelettmuskelbiopsieproben ausgeweitet, wobei die Werte bestätigt wurden und vor allem die für Muskeln im Vergleich zu Blut / Plasma beobachteten Werte in ähnlichen Bereichen und Verhältnissen lagen wie bei Nagetieren17. In den letzten Jahren haben auch andere Gruppen begonnen, den Nitrat- und Nitritgehalt in Skelettmuskelhomogenaten zu messen, und berichteten über vergleichbare Werte wie die unserer Gruppe20,21.
Ziel dieses Protokollpapiers ist es, die Herstellung von Skelettmuskelhomogenaten unter Verwendung von drei verschiedenen Homogenisierungsmethoden zur anschließenden Messung des Nitrat- und Nitritgehalts detailliert zu beschreiben. Zusätzlich wurden die Auswirkungen des zur Homogenisierung verwendeten Gewebegewichts auf die Werte von Nitrat und Nitrit in Skelettmuskelproben untersucht. Wir glauben, dass diese Methoden leicht auf andere Arten von Säugetiergeweben angewendet werden können. In jüngster Zeit wurde vor allem im Bereich der Sportphysiologie auf die möglichen Unterschiede in der Nitrat/Nitrit/NO-Physiologie nach Muskelgruppen geachtet. Wir berichten auch die Mengen an Nitrat und Nitrit in vier verschiedenen Nagetiermuskeln und finden eine ungleichmäßige Verteilung beider Ionen zwischen diesen verschiedenen Muskeln; Eine Beobachtung, die weiterer Untersuchungen bedarf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um Veränderungen der NO-Metaboliten, Nitrat und Nitrit, in Abhängigkeit von physiologischen Eingriffen zu überwachen, ist es unerlässlich, die Spiegel dieser Ionen in den verschiedenen Organen zu messen, die für ihren Stoffwechsel entscheidend sind. Da Hämoglobin im Blut mit NO und seinen Metaboliten reagiert, ist es auch wichtig, Blut so schnell wie möglich aus Gewebeproben zu entfernen. So wurden die Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, bevor sie Skelettmuskelgewebe (Gesäß, TA, EDL, Gastrocnemius-Muskel) sam…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das interne NIH / NIDDK-Stipendium ZIA DK 0251041-14 an Alan N Schechter, MD, unterstützt.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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