Her præsenterer vi en protokol for undersøgelse parring konkurrenceevne mandlige Aedes aegypti ved hjælp af fluorescerende farvestof som en markør. Kvindelige myg udsættes for både markerede og umærkede mænd til copulation. Post parring, deres spermathecae undersøges under en fluorescens mikroskop til at bestemme deres parring partner.
Succesen af sterile eller uforenelige insekt teknik-baserede befolkning undertrykkelse programmer afhænger af evnen til frigivet mænd til at konkurrere om vilde-type kvinder og fremkalde sterilitet i målgruppen. Derfor er laboratorievurdering af mandlig parrings konkurrenceevne afgørende for at evaluere frigivelsesstammens egnethed før feltudslip. Konventionelt udføres en sådan analyse ved at bestemme andelen af levedygtige æg produceret af hunnerne efter samtidig at være blevet udsat for to sæt hanner (vilde type- og frigivelsesstammer) til kopulation. Denne proces er imidlertid tidskrævende og besværlig på grund af behovet for først at blodfodre hunnerne til ægproduktion og derefter luge og opregne de udklækkede æg for at bestemme ægs levedygtighed.
Desuden kan denne metode ikke skelne graden af konkurrenceevne mellem to sterile eller Wolbachia-inficeredemyglinjer, da vilde kvindelige myg kun vil producere ikke-levedygtige æg ved parring med begge. For at omgå disse begrænsninger beskriver dette papir en mere direkte metode til måling af mandlig myggeparing konkurrenceevne i laboratoriemiljøer ved hjælp af fluorescerende farvestof, rhodamin B (RhB), som kan bruges til at markere mænd ved at fodre dem i saccharoseopløsning, der indeholder RhB. Efter parringsanalysen kan tilstedeværelsen af fluorescerende sædceller i spermathecae af en kvinde bruges til at bestemme hendes parringspartner. Denne metode er omkostningseffektiv, reducerer forsøgstiden med 90% og gør det muligt at sammenligne parringsformen mellem to sterile eller Wolbachia-inficeredelinjer.
Opdræt og frigivelse af sterile eller uforenelige hanner til undertrykkelse af Aedes mygpopulationer er i øjeblikket ved at blive evalueret i marken som et nyt værktøj til at forhindre udbrud af denguefeber og andre Aedes-båretsygdom1. Strategier for undertrykkelse af mænd, der i øjeblikket er i feltforsøg, omfatter brugen af den genetiske metode2, bestråling (Steril Insect Technique, SIT)3, endosymbiotiske bakterier Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT)4eller en kombination af de to sidstnævnte teknikker5,6. Succesen af disse tilgange er i høj grad afhængig af de frigivne mænds evne til at udkonkurrere vilde mænd og søge kvinder for at sikre copulation. Ellers kan sterilitet ikke induceres i målgruppen.
I et klassisk SIT-program kan mandlig parringsfitness for eksempel påvirkes af faktorer som bestrålingsdosis7,8,9, masseopdrætsprotokol og omfanget af indavl i kolonien10,11,12,13,14. Desuden kan undersøgelser af parringskonkurrenceevnen give vigtig viden om myg parring adfærd, som kan bruges til at informere vektor kontrol strategier.
I SIT og IIT vurderes parringskonkurrenceevnen for mandlige myg typisk ved at tillade både vildtype og frigivelsesstamme at konkurrere om vilde kvinder i et bur8,11,15,16. Kvinder er derefter blod-fodret og deres æg udklækket til at bestemme levedygtigheden. Kvinder, der lægger ikke-levedygtige æg eller æg med lav lugehastighed, antages at have parret sig med frigivelse stamme mænd, mens kvinder, der producerer levedygtige æg antages at have parret sig med vilde mænd. Parringskonkurrenceevnen beregnes derefter med Fried Index17. Desværre er denne metode ressourcekrævende og tidskrævende, og det samlede Fried Index kan påvirkes af eksterne forvirrende faktorer, der påvirker ægs levedygtigheden, såsom dårlig æghåndtering og overudledning, kan resultere i en lav lugehastighed i kompatibilitetskrydset, som derefter kan føre til et kunstigt lavt stegt indeks.
Desuden giver denne metode ikke mulighed for direkte sammenligning af parringskonkurrenceevnen mellem Aedes myg, der er inficeret med forskellige stammer af Wolbachia, eller som udsættes for forskellige doser bestråling. Der er derfor behov for en mere direkte metode til at tackle disse udfordringer. Nylige undersøgelser18,19 har vist effektiviteten af at bruge fluorescerende farvestof, RhB, at markere mandlige myg ‘sædvæske. Markeret sædvæske overføres og opbevares i de kvindelige mygs spermathecae ved vellykket parring, hvilket giver mulighed for direkte måling af kvindelig parring interaktion med markerede mænd. Rhodamine B er en thiol-reaktiv fluor farvestof almindeligt anvendt som biomarkør for økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser af dyr, herunder insekter20. Til myggeundersøgelser introduceres RhB ved fodring med sukker eller honningvand, der indeholder opløst RhB-pulver18,19,21,22,23,24. Ved optagelse binder RhB-farvestoffet sig til proteiner og farvning af kropsvæv med en rødlig-lyserød plet, der fluorescerer lyse orange under en fluorescerende lyskilde.
Det stærke fluorescenssignal og stabiliteten af mærkningen kombineret med dets evne til at plette insektskelvæsker giver mulighed for overvågning af overførslen af mærket sædvæske fra den mærkede han til sædopbevaringsorganerne hos det kvindelige insekt til parringsundersøgelser18,19,21,24. Brugen af RhB i en mandlig parring konkurrenceevne assay ikke kun tillader direkte måling af parring interaktion af kvinder med enten mærkede og umærkede mænd, men resultaterne kan også opnås inden for 24 timer, da det undgår processen med at bestemme æg levedygtighed, som typisk kræver omkring 10 til 14 dage. Desuden overvinder denne metode det potentielle tab af data, når de kvindelige myg ikke blodføder eller dør før ovipositionering. Dette er især afgørende, fordi i semi-felt forsøg, hvor kvindelige myg er tilbøjelige til at skade og død under post-parring indsamling ved hjælp af en rygsæk eller mekanisk aspirator. For at løse de nuværende begrænsninger ved at bruge kvindelig fertilitet til præsenterer vi en alternativ metode, der bruger RhB farvning til direkte at måle mandlige myg parring konkurrenceevne. Metoden forenkler arbejdsgangen, forkortede eksperimentel tid fra omkring to uger til en dag, hvilket giver mulighed for mere eksperimentelle replikeringer, der skal udføres og gør det muligt at sammenligne to frigivelsesstammer. Denne protokol vil være egnet til laboratorier, der er i gang med mandlige release-baserede myg befolkning undertrykkelse programmer, og kan bruges til rutinemæssig kvalitetskontrol og stamme evaluering.
Mærkning er almindeligt anvendt i entomologisk forskning for at studere insektpopulationsdynamik, spredning, adfærd og parringsbiologi26. I SIT- og IIT-programmer udføres mærkning for at differentiere frigivelsesstammen fra feltpopulationen for at studere deres spredning og optimere frigivelsesforholdet. De anvendte mærkningsmetoder omfatter genetisk mærkning27,28, der indeholder isotoper i larvefødevarer29,30, fluorescerende støv31ogfarvestof 32. Til undertrykkelse af mygpopulationer ved hjælp af SIT eller IIT, hvor mandlig parringsfitness er en kritisk komponent, er fluorescerende farvestoffer blevet brugt som markører til at studere mygparringsbiologi 18,19.
Konventionelt, vurdering af mandlige parring konkurrenceevne frigivelse stamme er blevet vurderet ved hjælp af kvindelige fertilitet assays. Denne analyse er imidlertid tidskrævende og arbejdskrævende på grund af downstream-eksperimentelle processer efter parring (supplerende figur S1). Disse processer omfatter blodfodring af hunnerne, ægopsamling, udklækning af æggene og optælling af andelen af udklækkede æg for at bestemme ægs levedygtighed. I gennemsnit kræver denne analyse 30 mandetimer og to ugers eksperimentelt arbejde (startende fra oprettelsen af konkurrenceevne assay bure) til den endelige bestemmelse af mandlige parring konkurrenceevne.
hans papir præsenterer brugen af et fluorescerende farvestof, RhB, (fodret som 0,2% RhB-saccharose til myggene, supplerende figur S2) til direkte at måle parringsinteraktioner mellem kvinder og RhB-mærkede hanner. Mens denne protokol kræver en fluorescens stereo mikroskop, det undgår behovet for at udføre de tidskrævende eksperimentelle procedurer, der er nævnt ovenfor. I gennemsnit kræver denne RhB-baserede analyse ca. 10 mandetimer og omkring en dag for at få data svarende til data fra kvindelige fertilitetsanalyser. Dette Dette >90% tidsbesparelser giver forskerne forskere mulighed for at udføre flere eksperimentelle replikter, hvilket giver en mere robust validering af mandlig parring fitness. Derudover kan denne analyse bruges til at sammenligne parringskonkurrenceevnen mellem to sterile eller Wolbachia-inficerede myglinjer.
Denne type sammenligning er ikke mulig med konventionelle kvindelige fertilitet assays, som kvinder ville give ikke-levedygtige æg ved parring med begge sådanne linjer. Uanset, enhver blandet parring i eksperimentet vil resultere i bias mod den markerede befolkning, da det er vanskeligt at identificere umærkede sædceller i kvindelige spermathecae, der indeholder sædvæske fra både RhB-mærket og umærkede mænd. En lignende konklusion blev draget i en undersøgelse, der vurderede, at Anopheles gambiaes konkurrenceevne ved hjælp af RhB18, hvorved en større andel af hunnerne i parringsanalysen viste sig at være parret med mærkede hanner. Da polyandry er mere tilbøjelige til at forekomme hos kvinder, der tidligere havde engageret sig i en afbrudt parring33, blev sandsynligheden for, at dette skete, reduceret i denne undersøgelse ved at bruge færre myg (20 hanner til 10 kvinder) i et større burvolumen (0,216 m3) i disse eksperimenter.
Resultaterne viste ingen bias mod RhB-mærket befolkning, hvilket indikerer, at blandet parring var begrænset. Sammenfattende, inkorporering af RhB at markere mænd i en parring konkurrenceevne assay er en økonomisk og hurtig måde at evaluere mandlige parring fitness. Denne metode giver også mulighed for direkte sammenligning af parring konkurrenceevne mellem mænd udsat for forskellige doser af bestråling, opdrættet i forskellige opdræt regimer, eller dem, der er inficeret med forskellige stammer af Wolbachia, hvilket gør det til et værdifuldt redskab til evaluering af mandlig parring fitness for enhver mandlig release-baseret myg befolkning undertrykkelse program.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af National Environment Agency (NEA), Singapore. Vi takker Hr. Chew Ming Fai, viceadministrerende direktør (Folkesundhed), NEA, for hans godkendelse til at offentliggøre undersøgelsen, og A / Prof Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, for hendes støtte i denne undersøgelse. Vi takker også Dr. Shuzhen Sim og Dr. Denise Tan for korrekturlæsning af manuskriptet.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
||
Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |