Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas
Summary
Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.
Abstract
Doenças degenerativas da retina são as principais causas de cegueira irreversível sem tratamento efetivo. Células-tronco pluripotentes que têm o potencial de se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo mini-tecidos da retina, possuem enormes promessas para pacientes com essas doenças e muitas oportunidades na modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos. No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é complicado e demorado. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado de indução da retina para gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e eficiência, adequados para várias células-tronco pluripotentes humanas. Este protocolo é realizado sem a adição de ácido retinóico, que beneficia o enriquecimento de fotorreceptores de cone. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina. Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará aplicações a jusante, como modelagem de doenças e terapia celular.
Introduction
As doenças degenerativas da retina (RD), como a degeneração macular relacionada à idade (ED) e a retinite pigmentosa (RP), são caracterizadas pela disfunção e morte de células fotorreceptoras e normalmente levam à perda irreversível da visão sem formas efetivas de cura1. O mecanismo subjacente a essas doenças é parcialmente desconhecido devido à falta de modelos de doenças humanas2. Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram realizados na medicina regenerativa através da tecnologia de células-tronco. Muitos pesquisadores, incluindo nós mesmos, mostraram que células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs), podem se diferenciar em todos os tipos de células da retina, mesmo tecidos mini-retinas através de várias abordagens de diferenciação3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando enorme potencial na modelagem da doença e na terapia celular12,13,14.
No entanto, o processo de indução de hPSCs para células de retina é altamente complicado e demorado com baixa repetibilidade, o que requer pesquisadores com rica experiência e altas habilidades. Durante o processo de indução complexa e dinâmica, uma série de fatores impactará o rendimento dos tecidos da retina15,16,17. Além disso, diferentes métodos de indução muitas vezes variam consideravelmente em tempo e expressão robusta de marcadores de retina, o que pode confundir a coleta de amostras e a interpretação dos dados3. Portanto, um protocolo simples de diferenciação de retina dos hPSCs com orientação passo a passo seria demandado.
Aqui, com base em nossos estudos publicados18,19,20,21, um protocolo otimizado de indução de retina para gerar organoides de retina (ROs) com fotorreceptores de cone rico de hPSCs, o que não requer o suplemento de ácido retinóico (RA). Este protocolo se concentra na descrição do método de várias etapas para gerar retina neural e RPE. A formação do EB é a parte essencial da fase inicial de indução. Tanto o tamanho quanto a densidade de revestimento dos EBs são otimizados quantitativamente, o que aumenta cientificamente o rendimento dos tecidos da retina e promove a repetibilidade. Na segunda parte da indução, vesículas ópticas (OVs) se auto-organizam na cultura de adesão e forma de ROs na cultura de suspensão; os cursos de tempo e eficiência desta parte variam consideravelmente em diferentes linhas hPSC. A maturação e especificação das células da retina em ROs ocorrem principalmente no estágio médio e tardio da indução. Sem a adição de RA, podem ser produzidos fotorreceptores maduros com cones ricos e hastes.
O objetivo deste protocolo é descrever quantitativamente e detalhar cada passo para pesquisadores inexperientes se repetirem. Várias linhas de hPSC foram induzidas com sucesso em ROs por este protocolo com um rendimento robusto de tecidos retinados ricos em cone e alta repetibilidade. Os ROs derivados do HPSCs com este protocolo podem recapitular os principais passos do desenvolvimento da retina in vivo, e sobreviver a longo prazo, o que facilita aplicações a jusante, como modelagem de doenças, rastreamento de medicamentos e terapia celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo de indução de retina de várias etapas, os HPSCs foram guiados passo a passo para ganhar o destino da retina, e auto-organizados em organoides de retina contendo NR e RPE laminados. Durante a diferenciação, os HPSCs recapitularam todos os principais passos do desenvolvimento da retina humana in vivo, desde EF, OV e RPE, até laminação da retina, gerando todos os subtipos de células da retina, incluindo células de gânglios da retina, células amacrinas, células bipolares, rod e fotorrece…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo National Key P&D Program of China (2016YFC1010103, 2017YFA0104101), o Fundo de Projetos de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (201803010078), o Projeto de Ciência & Tecnologia da Província de Guangdong (2017B020230003), a Natural Science Foundation (NSF) da China (81570874, 81970842), Cem programas de talentos da Universidade Sun Yat-sen (PT1001010) e os Fundos De Pesquisa Fundamental do Laboratório Estadual de Oftalmologia.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
Riferimenti
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