Analyse quantitative basée sur la microscopie confocale à balayage laser de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus dans le poumon de souris optiquement nettoyé à montage entier
Summary
Nous décrivons la méthode d’analyse quantitative de la distribution des conidies d’Aspergillus fumigatus (taille de 3 μm) dans les voies respiratoires de souris. La méthode peut également être utilisée pour l’analyse de la distribution des microparticules et des agglomérats de nanoparticules dans les voies respiratoires dans divers modèles d’état pathologique.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia sont des agents pathogènes en suspension dans l’air qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires humaines. Les personnes immunocompétentes sans allergies présentent une résistance et une tolérance immunologique, tandis que chez les patients immunodéprimés, les conidies peuvent coloniser les voies respiratoires et provoquer de graves troubles respiratoires invasifs. Diverses cellules dans différents compartiments des voies respiratoires sont impliquées dans la réponse immunitaire qui empêche l’invasion fongique; cependant, les aspects spatio-temporels de l’élimination des agents pathogènes ne sont pas encore complètement compris. L’imagerie tridimensionnelle (3D) d’organes de montage entier optiquement nettoyés, en particulier les poumons de souris expérimentales, permet de détecter des agents pathogènes marqués par fluorescence dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection. Dans la présente étude, nous décrivons une configuration expérimentale pour effectuer une analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires. En utilisant la microscopie à balayage laser confocale fluorescente (CLSM), nous avons tracé l’emplacement des conidies étiquetées par fluorescence dans les branches bronchiques et le compartiment alvéolaire 6 heures après l’application oropharyngée sur des souris. L’approche décrite ici était précédemment utilisée pour la détection de l’emplacement précis de l’agent pathogène et l’identification des cellules interagissant avec l’agent pathogène à différentes phases de la réponse immunitaire. La configuration expérimentale peut être utilisée pour estimer la cinétique de l’élimination de l’agent pathogène dans différentes conditions pathologiques.
Introduction
Sur une base quotidienne, les gens inhalent des agents pathogènes en suspension dans l’air, y compris des spores de champignons opportunistes Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) qui peuvent pénétrer dans les voies respiratoires1. Les voies respiratoires des mammifères sont un système de voies respiratoires de différentes générations qui se caractérisent par les différentes structures des parois des voiesrespiratoires2,3,4. Les parois trachéobronchiques sont constituées de plusieurs types de cellules parmi lesquelles des cellules ciliées qui fournissent la clairance mucociliaire5. Dans les alvéoles, il n’y a pas de cellules ciliées et les agents pathogènes pénétrants de l’espace alvéolaire ne peuvent pas être éliminés par la clairance mucociliaire6. De plus, chaque génération de voies respiratoires est une niche pour de multiples populations de cellules immunitaires et des sous-ensembles de ces populations sont uniques pour certains compartiments des voies respiratoires. Ainsi, les macrophages alvéolaires résident dans les compartiments alvéolaires, tandis que la trachée et les voies respiratoires conductrices sont tapissées de cellules dendritiques intraépithéliales7,8.
La taille approximative des conidies d’A. fumigatus est de 2 à 3,5 μm9. Étant donné que le diamètre des petites voies respiratoires chez l’homme et même chez la souris dépasse 3,5 μm, il a été suggéré que les conidies peuvent pénétrer dans l’espace alvéolaire2,10,11. En fait, l’examen histologique a montré la croissance fongique dans les alvéoles des patients souffrant d’aspergillose12. Des conidies ont également été détectées dans les alvéoles de souris infectées à l’aide d’une imagerie vivante des tranches pulmonaires épaisses13. Simultanément, des conidies ont été détectées dans le côté luminal de l’épithélium bronchique de souris14.
L’imagerie tridimensionnelle (3D) des poumons de souris à monture entière optiquement dégagés permet une analyse morphométrique des voies respiratoires15. En particulier, l’analyse quantitative de la distribution du nerf pleural viscéral a été réalisée à l’aide d’échantillons pulmonaires de souris optiquement éliminés15. Récemment, Amich et al.16 ont étudié la croissance fongique après application intranasale de conidies sur des souris immunodéprimées à l’aide d’une microscopie à fluorescence à feuille de lumière d’échantillons pulmonaires de souris optiquement nettoyés. L’emplacement précis des conidies de repos dans les voies respiratoires à différents moments après l’infection est important pour identifier les populations cellulaires qui peuvent fournir une défense antifongique suffisante dans certaines phases de l’inflammation. Cependant, en raison de sa taille relativement petite, les aspects spatio-temporels de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires sont mal caractérisés.
Nous présentons ici une configuration expérimentale pour l’analyse quantitative de la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires de souris infectées. En utilisant la microscopie confocale à balayage laser fluorescent (CLSM) des poumons optiquement nettoyés de souris qui ont reçu une application oropharyngée des conidies A. fumigatus étiquetées fluorescentes, nous obtenons des images 3D et effectuons le traitement d’image. En utilisant l’imagerie 3D du lobe pulmonaire à monture entière, nous avons précédemment montré la distribution des conidies d’A. fumigatus dans les voies respiratoires conductrices de souris 72 heures après l’application de conidies8.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie 3D d’organes entiers permet d’obtenir les données sans dissection de l’échantillon, ce qui est d’une grande importance pour étudier les aspects spatiaux de la distribution anatomique de l’agent pathogène dans l’organisme. Il existe plusieurs techniques et modifications du nettoyage optique tissulaire qui aident à surmonter la diffusion de la lumière laser et permettent l’imagerie d’organes entiers15,16,<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le professeur Sven Krappmann (hôpital universitaire d’Erlangen et FUA Erlangen-Nürnberg, Allemagne) d’avoir fourni la souche AfS150 de conidies Aspergillus fumigatus. Les auteurs remercient le service de presse du MIPT. V.B. remercie le Ministère des sciences et de l’enseignement supérieur de la Fédération de Russie (#075-00337-20-03, projet FSMG-2020-0003). Les travaux concernant l’imagerie et la quantification des conidies d’A. fumigatus ont été soutenus par RSF n° 19-75-00082. Les travaux concernant l’imagerie des voies respiratoires ont été soutenus par le RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Riferimenti
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