Confocal Laser Scanning Mikroskopi-baseret kvantitativ analyse af Aspergillus fumigatus Conidia Distribution i Hele Mount optisk ryddet Mus Lung
Summary
Vi beskriver metoden til kvantitativ analyse af fordelingen af Aspergillus fumigatus conidia (3 μm i størrelse) i musens luftveje. Metoden kan også anvendes til analyse af mikropartikler og nanopartikel agglomeratfordeling i luftvejene i forskellige patologiske tilstandsmodeller.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia er luftbårne patogener, der kan trænge ind i menneskelige luftveje. Immunkompetente mennesker uden allergi udviser resistens og immunologisk tolerance, mens conidia hos immunkompromitterede patienter kan kolonisere luftvejene og forårsage alvorlige invasive luftvejssygdomme. Forskellige celler i forskellige luftveje rum er involveret i immunrespons, der forhindrer svampeinvasion; de spatio-tidsmæssige aspekter af fjernelse af patogener er dog stadig ikke helt forstået. Tredimensionel (3D) billeddannelse af optisk rensede hele monteringsorganer, især lungerne fra eksperimentelle mus, gør det muligt at detektere fluorescerende mærkede patogener i luftvejene på forskellige tidspunkter efter infektion. I denne undersøgelse beskriver vi et eksperimentelt setup til at udføre en kvantitativ analyse af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene. Ved hjælp af fluorescerende konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM), spores vi placeringen af fluorescerende mærket conidia i bronchiale grene og alveolar rum 6 timer efter oropharyngeal anvendelse på mus. Den her beskrevne fremgangsmåde blev tidligere anvendt til påvisning af den nøjagtige patogenplacering og identifikation af de patogen-interagerende celler i forskellige faser af immunresponset. Den eksperimentelle opsætning kan bruges til at estimere kinetik af patogenet eliminering under forskellige patologiske forhold.
Introduction
På daglig basis indånder folk luftbårne patogener, herunder sporer af opportunistiske svampe Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia), der kan trænge ind i luftvejene1. Luftvejene af pattedyr er et system af luftveje af forskellige generationer, der er kendetegnet ved de forskellige strukturer i luftvejene2,3,4. Tracheobronchial vægge består af flere celletyper, blandt hvilke er ciliated celler, der giver slimhinde clearance5. I alveolerne er der ingen sammenklædede celler, og de gennemtrængende alveolarrumpatogener kan ikke elimineres ved den mucociliary clearance6. Desuden er hver luftvejsgenerering en niche for flere immuncellepopulationer, og delmængder af disse populationer er unikke for visse luftvejsrum. Således alveolar makrofager opholde sig i alveolar rum, mens både luftrør og ledende luftveje er foret med intraepithelial dendritiske celler7,8.
Den omtrentlige størrelse af A. fumigatus conidia er 2-3,5 μm9. Da diameteren af små luftveje hos mennesker og endda hos mus overstiger 3,5 μm, blev det foreslået, at conidia kan trænge ind i alveolarrummet2,10,11. Faktisk viste histologiske undersøgelser svampevæksten hos alveolerne hos de patienter, der lider af aspergillosis12. Conidia blev også påvist i alveolerne af inficerede mus ved hjælp af levende billeddannelse af de tykke lungeskiver13. Samtidig blev conidia påvist i den lysende side af bronchiale epitel af mus14.
Tredimensionel (3D) billeddannelse af de optisk ryddede helmonteringsmuse lunger tillader morfometrisk analyse af luftvejene15. Især blev den kvantitative analyse af den viscerale pleural nervefordeling udført ved hjælp af optisk ryddede muse lungeprøver15. For nylig undersøgte Amich et al.16 svampevæksten efter intranasal anvendelse af conidia på de immunkompromitterede mus ved hjælp af en lysarkfluorescensmikroskopi af optisk clearede muse lunger. Den nøjagtige placering af hvilekonidia i luftvejene på forskellige tidspunkter efter infektionen er vigtig for at identificere cellepopulationerne, der kan give tilstrækkeligt svampedræbende forsvar i visse faser af inflammation. På grund af den relativt lille størrelse er spatio-tidsmæssige aspekter af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene imidlertid dårligt karakteriseret.
Her præsenterer vi et eksperimentelt setup til kvantitativ analyse af A. fumigatus conidia distribution i luftvejene af inficerede mus. Ved hjælp af fluorescerende konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) af optisk ryddet lunger af mus, der har modtaget en oropharyngeal anvendelse af fluorescerende mærket A. fumigatus conidia, vi får 3D-billeder og udføre billedbehandling. Ved hjælp af 3D-billeddannelse af hele monterings lungeflappen har vi tidligere vist fordelingen af A. fumigatus conidia i de ledende luftveje af mus 72 timer efter conidia-applikation8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Helorgan 3D-billeddannelse gør det muligt at opnå dataene uden dissektion af prøven, hvilket er af stor betydning for at undersøge de rumlige aspekter af patogenets anatomiske fordeling i organismen. Der er flere teknikker og modifikationer af væv optisk clearing, der hjælper med at overvinde laserlys spredning og tillade hele organ billeddannelse15,16,18,19. En af de brugerdefinerede væ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker professor Sven Krappmann (Universitetshospitalet Erlangen og FUA Erlangen-Nürnberg, Tyskland) for at have leveret Aspergillus fumigatus conidia-stammen AfS150. Forfatterne takker MIPT Press Office. V.B. anerkender Den Russiske Føderations ministerium for videnskab og videregående uddannelse (#075-00337-20-03, projekt FSMG-2020-0003). Arbejdet vedrørende A. fumigatus conidia imaging og kvantificering blev støttet af RSF nr. Arbejdet med luftvejes billeddannelse blev understøttet af RFBR nr.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
Riferimenti
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
