Etablering og genmanipulation af Murine Hepatocyte organoider

Summary

Et langsigtet ex vitro 3D organoid kultursystem blev etableret fra musehæpatocytter. Disse organoider kan passage og genetisk manipuleres ved lentivirus infektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering.

Abstract

Leveren er det største organ hos pattedyr. Det spiller en vigtig rolle i glukoseopbevaring, proteinsekretion, metabolisme og afgiftning. Som eksekutor for de fleste af leveren funktioner, primære hepatocytter har begrænset voksende kapacitet. Dette kræver, at der oprettes ex vivo hepatocyt ekspansion modeller for lever fysiologisk og patologisk forskning. Her isolerede vi murine hepatocytter med to trin af kollagenaseperfusion og etablerede en 3D-organoidkultur som ‘minilever’ for at generogulere cellecelleinteraktioner og fysiske funktioner. Organoiderne består af heterogene cellepopulationer, herunder forfædre og modne hepatocytter. Vi introducerer processen i detaljeret at isolere og kultur murine hepatocytter eller foster hepatocyt at danne organoider inden for 2-3 uger og vise, hvordan man passage dem ved mekanisk pipetter op og ned. Derudover vil vi også introducere, hvordan man fordøjer organoiderne i enkeltceller til lentivirusinfektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering. Organoiderne kan bruges til lægemiddelskærme, sygdomsmodellering og grundlæggende leverforskning ved at modellere leverbiologi og patobiologi.

Introduction

Organoider er selvorganiserede, tredimensionelle (3D) in vitro-klynger, der omfatter selvfornyende stamceller og differentierede celler ^{med flere slægter1,2}. Organoiderne i mange organer er blevet etableret enten fra pluripotente eller voksne stamceller ved veldefinerede nichefaktorer, herunder tarmen, hjernen, tyktarmen, nyrerne, leveren, bugspytkirtlen, skjoldbruskkirtlen, maven, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoiderne generobrer fysiske cellefunktioner ved at efterligne enten udvikling (stammer fra embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, PSC’er) eller homøostase / regenerering progression (stammer fra voksne stamceller, ASCs), som åbner nye veje i sygdomsforskning og ^terapi8,9.

Som det største organ hos pattedyr er leveren primært ansvarlig for opbevaring, metabolisme og afgiftning. To slags epitelcelletyper, hepatocytter og cholangiocytter, konstruere den grundlæggende enhed af en leverlobule. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% af ^{leverfunktionen10}. Selv om leveren har bemærkelsesværdig regenerering kapacitet, hurtigt tab af hepatocyt funktioner sker under traditionelle monolayer dyrkning af dysreguleret celle polarisering og dedifferentiation, hvilket øger behovet for forskere og klinikere til at opbygge ‘gap-bridging’ lever modeller i en skål. Indtil for nylig havde ex vivo-ekspansionsmodellerne fra primære hepatocytter imidlertid ikke været veletablerede11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale / inducerede pluripotente stamceller, fibroblast konvertering til hepatocyt-lignende celler, og væv-afledte celler. Udviklingen af leverorganoider øger anvendelsen af en in vitro-model til lægemiddelskærme og levertoksicitetsanalyser16,17.

Her beskriver vi en detaljeret protokol til etablering af leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved at bruge denne protokol, vi oprettet en in vitro kultur system af hepatocyt organoider med to perfusioner af kollagenase. Disse organoider kan passeres for langsigtet ekspansion i flere måneder. Deres fysiologiske funktion er meget i overensstemmelse med hepatocytter. Derudover giver vi også en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører genmanipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA transduktion og CRISPR-Cas9-teknik ved hjælp af organoider. Udbredelsen af hepatocytorganoider kaster lys over muligheden for at bruge organoider til at forstå leverbiologi og udvikle personlige og translationelle medicintilgange.

Protocol

Alle mus eksperimenter blev godkendt af Animal Care and Use Committee af School of Basic Medical Sciences på Shandong University og blev udført i henhold til licensen i henhold til Home Office retningslinjer og regler (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079). BEMÆRK: Denne protokol bruges hovedsageligt til at dyrke 3D-organoider fra isolerede primære hepatocytter. 1. Etablering af Murine Hepatocyte Organoid Kultur BEMÆRK: Ekstracellulære matrix sås…

Representative Results

Hepatocyt organoider fra kvindelige Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 uger) blev observeret fem dage efter såning (Figur 1A). Organoiderne breder sig med Ki67 positiv farvning (figur 1B). Interfererende udtryk for repræsentative gener i hepatocytorganoider enten ved siRNA transinfektion eller lentivirusinfektion blev undersøgt af qRT-PCR og western blot. Resultaterne er vist i figur 2A og 2B. Figur …

Discussion

Evnen til at kultur modne hepatocytter over lange perioder er grundlæggende i at studere lever grundlæggende videnskab, narkotika toksikologi og hepatotropiske host-mikrobiologi infektioner såsom malaria og hepatitis virus. Med en veldefineret niche opretter protokollen her et kultursystem for hepatocytter. Denne protokol driver modne hepatocytter til at udvide i 3D-kultur med en heterogenitet, der opsummerer celle-celle interaktion, de fleste hepatocyt funktion og genetiske modifikationer, så design af genfunktion u…

Materials

Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C