Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu
Summary
Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.
Abstract
Karaciğer memelilerdeki en büyük organdır. Glikoz depolama, protein salgılama, metabolizma ve detoksifikasyonda önemli bir rol oynar. Karaciğer fonksiyonlarının çoğu için uygulayıcı olarak, birincil hepatositler sınırlı çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu, karaciğer fizyolojik ve patolojik araştırmalar için ex vivo hepatosit genleşme modellerinin kurulmasını gerektirir. Burada, murine hepatositleri iki adım kollajenaz perfüzyonu ile izole ettik ve hücre-hücre etkileşimlerini ve fiziksel fonksiyonları yeniden oluşturmak için ‘mini karaciğer’ olarak 3D organoid kültürü kurduk. Organoidler, progenitörler ve olgun hepatositler de dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonlarından oluşur. 2-3 hafta içinde organoid oluşturmak için murine hepatositleri veya fetal hepatositleri izole etmek ve kültüre etmek ve mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek nasıl geçişlerini göstereceğimizi göstermek için süreci ayrıntılı olarak tanıtıyoruz. Ek olarak, shRNA / ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu için organoidlerin tek hücreye nasıl sindirileceğini de tanıtacağız. Organoidler, karaciğer biyolojisi ve patobiyolojisi modellenerek ilaç elekleri, hastalık modellemesi ve temel karaciğer araştırmaları için kullanılabilir.
Introduction
Organoidler, kendi kendini yenileyen kök hücreleri ve çok soylu farklılaştırılmış hücreleri içeren kendi kendine organize edilmiş, üç boyutlu (3D) in vitro kümelerdir1,2. Birçok organın organoidleri, bağırsak, beyin, kolon, böbrek, karaciğer, pankreas, tiroid, mide, cilt ve akciğer3,4,5,6,7 gibi iyi tanımlanmış niş faktörlerle pluripotent veya yetişkin kök hücrelerinden kurulmuştur. . Organoidler, hastalık araştırma ve tedavisinde yeni yollar açan gelişim (embriyonik veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, PSC’lerden) veya homeostaz/rejenerasyon ilerlemesini (yetişkin kök hücrelerinden, ASC’lerden kaynaklanır) taklit ederek fiziksel hücre fonksiyonlarını yeniden kapsüllerler8,9.
Memelilerde en büyük organ olarak, karaciğer esas olarak depolama, metabolizma ve detoksifikasyondan sorumludur. İki tür epitel hücre tipi, hepatositler ve kolanjiositler, bir karaciğer lobüllerinin temel birimini oluşturur. Hepatositler karaciğer fonksiyonlarının % 70-80’inden sorumludur10. Karaciğer olağanüstü rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit özelliklerinin hızlı kaybı, düzensiz hücre polarizasyonu ve adanmışlık ile geleneksel monolayer kültleme sırasında meydana gelir ve bu da araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tabakta ‘boşluk köprüleme’ karaciğer modelleri inşa etme ihtiyacını arttırır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar birincil hepatositlerden ex vivo genişletme modelleri iyi kurulmamıştı11,12,13,14,15. Karaciğer organoidleri embriyonik/indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, fibroblast hepatosit benzeri hücrelere ve dokudan türetilmiş hücrelerden kurulabilir. Karaciğer organoidlerinin gelişimi, ilaç elekleri ve karaciğer toksisitesi tahlilleri için bir in vitro modelin uygulanmasını artırır16,17.
Burada, murine primer hepatositlerden karaciğer organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, kollajenazın iki perfüzyonu ile hepatosit organoidlerinden oluşan bir in vitro kültür sistemi kurduk. Bu organoidler aylarca uzun süreli genişleme için geçiş yapılabilir. Fizyolojik fonksiyonları hepatositlerle oldukça uyumludur. Ayrıca, organoidler kullanılarak lentivirüs enfeksiyonu, siRNA transdüksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliği gibi genetik manipülasyonun nasıl gerçekleştirildiğinin ayrıntılı bir açıklamasını da sunuyoruz. Hepatosit organoidlerinin yayılması, karaciğer biyolojisini anlamak ve kişiselleştirilmiş ve çevirisel tıp yaklaşımları geliştirmek için organoid kullanma olasılığına ışık tutmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olgun hepatositleri uzun süreler boyunca kültürleme yeteneği, karaciğer temel bilimi, ilaç toksikolojisi ve sıtma ve hepatit virüsleri gibi hepatotropik konak mikrobiyoloji enfeksiyonlarının incelenmesinde temeldir. İyi tanımlanmış bir niş ile, protokol burada hepatositler için bir kültür sistemi kurar. Bu protokol, olgun hepatositlerin hücre-hücre etkileşimini, çoğu hepatosit fonksiyonunu ve genetik değişiklikleri yeniden sağlayan bir heterojenlikle 3D kültüründe genişlemesini sağlar ve ge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Profesör Hans Clevers’e rekombinant R-spondin1 üretmek için hücre hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı’ndan (2019YFA0111400), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (31970779) H.H.’ye ve Shandong Üniversitesi Gençler Arası ve İnovasyon Araştırma Grubu’ndan (2020QNQT003) H.H.’ye verilen hibelerle desteklendi.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
Riferimenti
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
