Etablering och genetisk manipulering av Murine Hepatocyte Organoids

Summary

Ett långsiktigt ex vitro 3D organoid kultursystem inrättades från mus hepatocyter. Dessa organoider kan passeras och genetiskt manipuleras av lentivirus infektion av shRNA/ektopisk konstruktion, siRNA transfection och CRISPR-Cas9 teknik.

Abstract

Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en viktig roll i glukoslagring, proteinsekresion, metabolism och avgiftning. Som exekutor för de flesta leverfunktioner har primära hepatocyter begränsad prolifererande kapacitet. Detta kräver upprättandet av ex vivo hepatocytexpansion modeller för leverfysiologisk och patologisk forskning. Här isolerade vi murin hepatocyter genom två steg av kollagenas perfusion och etablerade en 3D organoid kultur som “mini-lever” för att rekapitulera cell-cell interaktioner och fysiska funktioner. Organoiderna består av heterogena cellpopulationer inklusive stamceller och mogna hepatocyter. Vi introducerar processen i detalj för att isolera och odla murin hepatocyter eller fetala hepatocyter för att bilda organoider inom 2-3 veckor och visa hur man passerar dem genom att mekaniskt pipettera upp och ner. Dessutom kommer vi också att introducera hur man smälter organoiderna i enstaka celler för lentivirusinfektion av shRNA / utomkvedskonstruktion, siRNA-transfektion och CRISPR-Cas9-teknik. Organoiderna kan användas för läkemedelsskärmar, sjukdomsmodellering och grundläggande leverforskning genom modellering av leverbiologi och patobiologi.

Introduction

Organoider är självorganiserade, tredimensionella (3D) in vitro-kluster som inkluderar självförnyande stamceller och differentierade multi-lineageceller1,2. Organoiderna i många organ har etablerats antingen från pluripotenta eller vuxna stamceller av väldefinierade nischfaktorer inklusive tarmen, hjärnan, tjocktarmen, njuren, levern, bukspottkörteln, sköldkörteln, magen, huden och lungan3,4,5,6,7 . Organoiderna rekapitulerar fysiska cellfunktioner genom att efterlikna antingen utveckling (som härrör från embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller, PSC) eller homeostas/regenereringsprogression (härrör från vuxna stamceller, ASCs), vilket öppnar nya vägar inom sjukdomsforskning och ^terapi8,9.

Som det största organet hos däggdjur är levern främst ansvarig för lagring, metabolism och avgiftning. Två typer av epitelial celltyper, hepatocyter och cholangiocyter, konstruera den grundläggande enheten i en leverlobule. Hepatocyter är ansvariga för 70-80% av ^{leverfunktionen10}. Även om levern har anmärkningsvärd regenereringskapacitet, sker snabb förlust av hepatocytfunktioner under traditionell monolayer-odling av dysreglerad cellpolarisering och dedifferentiation, vilket ökar behovet av forskare och kliniker att bygga “gap-överbryggande” levermodeller i en maträtt. Fram till nyligen hade dock ex vivo-expansionsmodellerna från primära hepatocyter inte varit väletablerade11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableras från embryonala/inducerade pluripotenta stamceller, fibroblastkonvertering till hepatocytliknande celler och vävnadsbaserade celler. Utvecklingen av leverorganoider ökar tillämpningen av en in vitro-modell för läkemedelsskärmar och levertoxicitetsanalyser16,17.

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att fastställa lever organoider från murine primära hepatocyter. Genom att använda detta protokoll, vi inrätta ett in vitro kultursystem av hepatocyt organoider med två perfusioner av kollagenas. Dessa organoider kan passeras för långsiktig expansion i månader. Deras fysiologiska funktion är mycket förenlig med hepatocyter. Dessutom ger vi också en detaljerad beskrivning av hur man utför genetisk manipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA-transduktion och CRISPR-Cas9-teknik med hjälp av organoider. Förökningen av hepatocytorganoider belyser möjligheten att använda organoider för att förstå leverbiologi och utveckla personliga och translationella medicinska metoder.

Protocol

Alla mössexperiment godkändes av Animal Care and Use Committee vid School of Basic Medical Sciences vid Shandong University och utfördes enligt licensen enligt Home Office riktlinjer och förordningar (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079). OBS: Detta protokoll används främst för att odla 3D-organoider från isolerade primära hepatocyter. 1. Upprättande av Murine Hepatocyte Organoid Kultur OBS: Extracellulär matris som Matrigel eller BME använ…

Representative Results

Hepatocytorganoiderna från kvinnliga Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 veckor) observerades fem dagar efter sådd (figur 1A). Organoiderna fortplantar sig med Ki67 positiv färgning (figur 1B). Störande uttryck av representativa gener i hepatocyt organoider antingen genom siRNA transfection eller lentivirus infektion undersöktes av qRT-PCR och västra blot. Resultaten visas i figur 2A och 2B. Figur …

Discussion

Förmågan att odla mogna hepatocyter under långa perioder är grundläggande för att studera lever grundläggande vetenskap, läkemedelstoxikologi och hepatotropa värdmikrobiologi infektioner såsom malaria och hepatitvirus. Med en väldefinierad nisch inrättar protokollet här ett kultursystem för hepatocyter. Detta protokoll driver mogna hepatocyter att expandera i 3D-kulturen med en heterogenitet som rekapitulerar cell-cellinteraktion, de flesta hepatocytfunktion och genetiska modifieringar, vilket möjliggör d…

Materials

Perfusion Buffer
EGTA	Sangon Bitech	A600077-0100	3.50 g/L
Glucose	Sangon Bitech	A100188-0500	9.00 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Phenol Red	Sangon Bitech	A100882-0025	0.06 g/L
Digestion Buffer
CaCl2	Sangon Bitech	A501330-0005	0.50 M
Collagenase IV	Sigma	C1639	0.10 mg/mL
HEPES	Sangon Bitech	C621110-0010	23.80 g/L
KCl	Sangon Bitech	A100395-0500	4.00 g/L
Na2HPO4·12H2O	Sangon Bitech	A501727-0500	1.51 g/L
NaCl	Sangon Bitech	A501218-0001	80.0 g/L
NaH2PO4·2H2O	Sangon Bitech	A610404-0500	0.78 g/L
NaHCO3	Sangon Bitech	A500873-0500	3.50 g/L
Tip-wash Buffer
Fetal Bovine Serum	Gibco	10091148	stored at 4 °C
DPBS	Gibco	C14190500BT0	stored at 4 °C
Wash Medium
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Culture Medium
A83-01	Tocris	2939	Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	stored at 4 °C
B-27 supplement 50x, minus vitamin A	Gibco	1704-044	50 X
Chir 99021	Tocris	4423	Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM
DMEM/F12	Gibco	11330032	stored at 4 °C
Gastrin I	Tocris	3006	Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM
GlutaMAX	Gibco	35050-061	100 X
HEPES	Gibco	15630-080	100 X
Matrigel martix	BD	356231	stored at -20 °C
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich	A9165	Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM
Nictinamide	Sigma Aldrich	N0636	Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM
Penicillin/streptomycin	Sangon Bitech	A600135-0025	100 X
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15	Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml
Recombinant Human TGF-α	Peprotech	100-16A	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Recombinant Human TNF-α	Origene	TP750007-1000	Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml
Rho kinase inhibitor Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 dihydrochloride	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Rspondin-1conditioned medium			Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.
Others
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE
16 # silicone tube	LangerPump
24 well, suspension	Greiner bio-one	GN662102-100EA
37 °C Water Bath
70 µm filter	BD	352350
Accutase	stemcell	AT-104	stored at 4 °C
Anti-CTNNB1	BD	610154	Mouse
Anti-GAPDH	CST	5174S	Rabbit
Anti-HDAC7	Abcam	ab50212	Mouse
Anti-KI67	Abcam	ab15580	Rabbit
Biological safety cabinet	ESCO	CCL-170B-8
Cell Recovery Solution	Corning	354253	stored at 4 °C
Centrifuge 5430	eppendorf	542700097
CO2 incubator	ESCO	AC2-4S1
DMSO	Sangon Bitech	A100231	stored at RT
EVOS FL Color Imaging Systems	Invitrogen	AME4300
Hdac3 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909192555	stored at -20 °C
Hdac7 lentivirus	ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd	LV2020-2364	stored at -80 °C
Hitrans G A	Shanghai Genechem Co.,Ltd.	REVG004	Increased virus infection efficiency
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	Increased virus infection efficiency
Live cell dye	Luna	F23001	stored at 4 °C
Low-speed desktop centrifuge	cence	TD5A-WS/TD5AWS
Nucleofactor-α 2b Device	Lonza
Opti-MEM	Gibco	31985070	stored at 4 °C
Pasteur pipette	Sangon Bitech	F621006-0001
Peristaltic pump	LangerPump	BT100-2J
PVDF membrane	Millipore	IPVH00010	Activate with methanol
PX458	Addgene	48138	stored at -80 °C
Refrigerated centrifuge	Thermo Scientific Heraeus	Labofuge 400
RSL3	MCE	HY-100218A	Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM
Trypsin/EDTA	Gibico	25200072	stored at 4 °C
Wee1 siRNA	Guangzhou RiboBio Co., Ltd.	siG2003180909205971	stored at -20 °C