عزل خلايا الصمام الأولي البشري لنمذجة الأمراض في المختبر
Summary
يصف هذا البروتوكول مجموعة الصمامات الأبهرية البشرية المستخرجة أثناء إجراءات استبدال الصمام الأبهري الجراحية أو من الأنسجة الجثة ، والعزل اللاحق والتوسع والتوصيف للخلايا البطانية والخلالية للصمام الأولي الخاصة بالمريض. يتم تضمين تفاصيل مهمة تتعلق بالعمليات اللازمة لضمان بقاء الخلية وخصوصية النمط الظاهري.
Abstract
مرض الصمام الأبهري الكلسي (CAVD) موجود في ما يقرب من ثلث السكان المسنين. يؤدي سماكة الصمام الأبهري وتصلبه وتكلسه إلى تضيق الأبهر ويساهم في فشل القلب والسكتة الدماغية. التسبب في المرض متعدد العوامل ، والضغوط مثل الالتهاب ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية ، والتدفق المضطرب ، والإجهاد الميكانيكي والإجهاد تساهم في التمايز العظمي للخلايا البطانية للصمام والخلايا الخلالية للصمام. ومع ذلك ، فإن عوامل البدء الدقيقة التي تدفع الانتقال العظمي للخلية السليمة إلى خلية متكلسة ليست محددة بالكامل. علاوة على ذلك ، فإن العلاج الحالي الوحيد لتضيق الأبهر الناجم عن CAVD هو استبدال الصمام الأبهري ، حيث يتم إزالة الصمام الأصلي (استبدال الصمام الأبهري الجراحي ، SAVR) أو يتم إدخال صمام بديل قابل للطي بالكامل عبر قسطرة (استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة ، TAVR). هذه العمليات الجراحية تأتي بتكلفة عالية ومع مخاطر جسيمة. وبالتالي ، فإن تحديد أهداف علاجية جديدة لاكتشاف الأدوية أمر حتمي. تحقيقا لهذه الغاية ، تطور الدراسة الحالية سير عمل حيث يتم استخدام الأنسجة التي تمت إزالتها جراحيا من المرضى وأنسجة جثث المتبرعين لإنشاء خطوط أولية خاصة بالمريض من الخلايا الصمامية لنمذجة الأمراض في المختبر. يقدم هذا البروتوكول استخدام محلول التخزين البارد ، الذي يشيع استخدامه في زراعة الأعضاء ، لتقليل الضرر الناجم عن وقت الشراء الطويل في كثير من الأحيان بين استئصال الأنسجة والمعالجة المختبرية مع الاستفادة من استقرار خلايا الأنسجة المستأصلة بشكل كبير. توضح نتائج الدراسة الحالية أن خلايا الصمام المعزولة تحتفظ بقدرتها التكاثرية والأنماط الظاهرية البطانية والخلالية في المزرعة حتى عدة أيام بعد إزالة الصمام من المتبرع. يسمح استخدام هذه المواد بجمع خلايا التحكم وخلايا CAVD ، والتي يتم من خلالها إنشاء كل من خطوط خلايا التحكم والمرض.
Introduction
مرض الصمام الأبهري الكلسي (CAVD) هو مرض مزمن يتميز بالالتهاب والتليف والتكلس الكبير لوريقات الصمام الأبهري. يمكن أن تؤدي إعادة البناء التدريجي وتكلس المنشورات (يسمى تصلب الأبهر) إلى إعاقة تدفق الدم (تضيق الأبهر) مما يساهم في السكتة الدماغية ويؤدي إلى قصور القلب. حاليا العلاج الوحيد ل CAVD هو استبدال الصمام الأبهري الجراحي أو عبر القسطرة (SAVR و TAVR ، على التوالي). لا يوجد خيار غير جراحي لوقف أو عكس تطور CAVD ، وبدون استبدال الصمام ، تقترب معدلات الوفيات من 50٪ في غضون 2-3 سنوات1،2،3. إن تحديد الآليات الأساسية التي تقود هذا المرض سيحدد الأساليب العلاجية الجديدة المحتملة.
في البالغين الأصحاء ، يبلغ سمك وريقات الصمام الأبهري حوالي ملليمتر واحد ، وتتمثل وظيفتها الرئيسية في الحفاظ على تدفق الدم أحادي الاتجاه من البطين الأيسر4. تتكون كل وريقة من الوريقات الثلاث من طبقة من الخلايا البطانية الصمامية (VECs) التي تبطن السطح الخارجي للوريقة وتعمل كحاجز. تحافظ VECs على توازن الصمام من خلال تنظيم النفاذية ، والتصاق الخلايا الالتهابية ، وإشارات paracrine5،6،7. تتكون الخلايا الخلالية للصمام (VICs) من غالبية الخلايا داخل نشرة الصمام8. يتم ترتيب VICs في ثلاث طبقات مميزة في النشرة. تعرف هذه الطبقات باسم البطين والإسفنجي والليبروزا9. يواجه البطين البطين الأيسر ويحتوي على ألياف الكولاجين والإيلاستين. تحتوي الطبقة الوسطى ، الإسفنجية ، على نسبة عالية من البروتيوغليكان الذي يوفر مرونة القص أثناء الدورة القلبية. تقع طبقة الفيبروس الخارجية بالقرب من سطح التدفق على الجانب الأبهري وهي غنية بالكولاجين الليفي من النوع الأول والنوع الثالث الذي يوفر القوة للحفاظ على التكيف أثناء الانبساط10،11،12. توجد VICs في حالة هدوء ، ومع ذلك ، فإن عوامل مثل الالتهاب ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والإجهاد الميكانيكي قد تعطل توازن VIC8،9،13،14،15،16. مع فقدان التوازن ، تنشط VICs وتكتسب نمطا ظاهريا شبيها بالخلايا الليفية العضلية قادرا على تكاثر وتقلص وإفراز البروتينات التي تعيد تشكيل ميليو17 خارج الخلية. يمكن أن تنتقل VICs المنشطة إلى خلايا متكلسة تذكرنا بتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) إلى بانيات عظمية 15،17،18،19،20،21،22،23،24،25.
يبدو أن التكلس يبدأ في طبقة الألياف الغنية بالكولاجين من مساهمات كل من VECs و VICs ولكنه يتوسع ويغزو الطبقات الأخرى من النشرة8. وبالتالي ، من الواضح أن كلا من VECs و VICs يستجيبان للمحفزات لتنظيم التعبير عن الجينات العظمية ، ومع ذلك ، فإن الأحداث الدقيقة التي تقود تنشيط الجينات العظمية ، وكذلك التفاعل المعقد بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية للنشرة ، لا تزال غير محددة. نماذج الفئران ليست مصدرا مثاليا لدراسة الدوافع غير الوراثية لمرض CAVD ، حيث أن الفئران لا تطور CAVD de novo26,27 ، وبالتالي فإن استخدام الأنسجة البشرية الأولية وخطوط الخلايا الأولية المعزولة من هذه الأنسجة أمر ضروري. على وجه الخصوص ، الحصول على هذه الخلايا بأعداد كبيرة ونوعية جيدة أمر حتمي ، حيث أن مجال ثقافات الخلايا 3D والنمذجة العضوية يتوسع ومن المرجح أن يصبح بديلا قائما على الإنسان خارج الجسم الحي لنماذج الفئران.
الغرض من الطريقة الحالية هو مشاركة سير العمل الذي هيأ الظروف لعزل وتنمية VECs و VICs التي تم الحصول عليها بكفاءة من الصمامات التي تمت إزالتها جراحيا من المتبرعين البشريين. أظهرت الدراسات السابقة عزلا ناجحا ل VECs و VICs من الخنازير28 وصمامات الفئران29 ، على حد علمنا هذا هو الأول الذي يصف عزل هذه الخلايا في الأنسجة البشرية. ينطبق البروتوكول الموصوف هنا على الصمامات البشرية المستأصلة ويتحايل بشكل كبير ويحسن الضرر الناجم عن وقت الشراء الطويل في كثير من الأحيان بين استئصال الأنسجة والمعالجة المختبرية من خلال إدخال استخدام محلول التخزين البارد ، وهو محلول مخزن يستخدم سريريا في عمليات زرع الأعضاء التي تعمل على استقرار خلايا الأنسجة المستأصلة بشكل كبير. يوضح البروتوكول الموصوف هنا أيضا كيفية تحديد النمط الظاهري للخلية وضمان كفاءة عالية لبقاء الخلية مع الحد الأدنى من التلوث المتبادل للخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الحصول على أنسجة السيطرة والمرض من البشر أمرا بالغ الأهمية لنمذجة الأمراض في المختبر وخارج الجسم الحي. ومع ذلك ، في حين أن المرء يتحدث في كثير من الأحيان عن تحديات سد الفجوة بين مقاعد البدلاء إلى جانب السرير ، فإن الترتيب العكسي – الانتقال من الجناح الجراحي إلى المقعد – غالبا ما يكون فجو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر جيسون دوبينز على المناقشة الثاقبة والقراءة النقدية لهذه المخطوطة. نود أن نعرب عن تقديرنا لمركز استعادة الأعضاء والتعليم لمساعدتهم ودعمهم ونشكر المتبرعين بالأنسجة وعائلاتهم على جعل هذه الدراسة ممكنة. يتم جمع جميع عينات المرضى من الأفراد المسجلين في الدراسات المعتمدة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بيتسبرغ وفقا لإعلان هلسنكي. تمت الموافقة على الأنسجة الجثة التي تم الحصول عليها عن طريق مركز استعادة الأعضاء والتعليم (CORE) من قبل لجنة جامعة بيتسبرغ للإشراف على البحوث والتدريب السريري الذي يشمل المتوفين (CORID).
بعض الشخصيات التي تم إنشاؤها باستخدام Biorender.com.
يتم دعم CSH من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم K22 HL117917 و R01 HL142932 ، جمعية القلب الأمريكية 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Riferimenti
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment–insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells – A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
