Dit protocol beschrijft de verzameling menselijke aortakleppen geëxtraheerd tijdens chirurgische aortaklepvervangingsprocedures of uit cadaverische weefsel, en de daaropvolgende isolatie, uitbreiding en karakterisering van patiëntspecifieke primaire klep endotheel- en interstitiële cellen. Inbegrepen zijn belangrijke details over de processen die nodig zijn om de levensvatbaarheid van cellen en fenotypespecificiteit te garanderen.
Calcific aortic valve disease (CAVD) is aanwezig bij bijna een derde van de oudere bevolking. Verdikking, verstijving en verkalking van de aortaklep veroorzaakt aortastenose en draagt bij aan hartfalen en beroerte. Ziektepathogenese is multifactorieel en spanningen zoals ontsteking, extracellulaire matrixremodellering, turbulente stroming en mechanische stress en spanning dragen bij aan de osteogene differentiatie van klep endotheel- en klepinterstitiële cellen. De precieze initiërende factoren die de osteogene overgang van een gezonde cel naar een verkalkende cel aansturen, zijn echter niet volledig gedefinieerd. Verder is de enige huidige therapie voor CAVD-geïnduceerde aortastenose aortaklepvervanging, waarbij de oorspronkelijke klep wordt verwijderd (chirurgische aortaklepvervanging, SAVR) of een volledig inklapbare vervangingsklep wordt ingebracht via een katheter (transkatheter aortaklepvervanging, TAVR). Deze chirurgische ingrepen brengen hoge kosten met zich mee en brengen ernstige risico’s met zich mee; het identificeren van nieuwe therapeutische doelen voor het ontdekken van geneesmiddelen is dus absoluut noodzakelijk. Daartoe ontwikkelt de huidige studie een workflow waarbij chirurgisch verwijderde weefsels van patiënten en donorkadaverweefsels worden gebruikt om patiëntspecifieke primaire lijnen van valvulaire cellen te creëren voor in vitro ziektemodellering. Dit protocol introduceert het gebruik van een koude opslagoplossing, die vaak wordt gebruikt bij orgaantransplantatie, om de schade te verminderen die wordt veroorzaakt door de vaak lange verkrijgingstijd tussen weefselexcisie en laboratoriumverwerking met het voordeel van sterk stabiliserende cellen van het weggesneden weefsel. De resultaten van deze studie tonen aan dat geïsoleerde klepcellen hun proliferatieve capaciteit en endotheel- en interstitiële fenotypen in cultuur behouden tot enkele dagen na het verwijderen van de klep van de donor. Het gebruik van deze materialen maakt het mogelijk om controle- en CAVD-cellen te verzamelen, waaruit zowel controle- als ziektecellijnen worden vastgesteld.
Calcific aortic valve disease (CAVD) is een chronische pathologie die wordt gekenmerkt door ontsteking, fibrose en macrocalcificatie van aortaklepblaadjes. Progressieve remodellering en verkalking van de bijsluiters (aortastclerose genoemd) kan leiden tot de obstructie van de bloedstroom (aortastenose) die bijdraagt aan een beroerte en leidt tot hartfalen. Momenteel is de enige behandeling voor CAVD chirurgische of transkatheter aortaklepvervanging (respectievelijk SAVR en TAVR). Er is geen niet-chirurgische optie om de CAVD-progressie te stoppen of om te keren, en zonder klepvervanging naderen de sterftecijfers 50% binnen 2-3 jaar 1,2,3. Het definiëren van de onderliggende mechanismen die deze pathologie aansturen, zal potentiële nieuwe therapeutische benaderingen identificeren.
Bij een gezonde volwassene zijn aortaklepblaadjes ongeveer een millimeter dik en hun belangrijkste functie is om de unidirectionele bloedstroom uit de linker ventrikelte behouden 4. Elk van de drie blaadjes bestaat uit een laag klep endotheelcellen (VEC’s) die het buitenoppervlak van de folder bekleedt en als barrière fungeert. VEC’s handhaven klephomeostase door de permeabiliteit, inflammatoire celhechting en paracriene signalering 5,6,7 te reguleren. Klepinterstitiële cellen (VICs) omvatten de meerderheid van de cellen in de klepdeel8. VICs zijn in de folder gerangschikt in drie onderscheidende lagen. Deze lagen staan bekend als de ventriculaireis, de spongiosa en de fibrosa9. De ventriculaireis kijkt uit op de linker ventrikel en bevat collageen- en elastinevezels. De middelste laag, de spongiosa, bevat een hoog proteoglycaangehalte dat schuifflexibiliteit biedt tijdens de hartcyclus. De buitenste fibrosalaag bevindt zich dicht bij het uitstroomoppervlak aan de aortazijde en is rijk aan type I en type III fibrillair collageen dat sterkte biedt om coaptatie te behouden tijdens diastole 10,11,12. VICs bevinden zich in een rustige toestand, maar factoren zoals ontsteking, remodellering van de extracellulaire matrix (ECM) en mechanische stress kunnen VIC-homeostaseverstoren 8,9,13,14,15,16. Met verlies van homeostase activeren en verwerven VICs een myofibroblastachtig fenotype dat in staat is tot proliferatie, contractie en secretie van eiwitten die de extracellulaire millieu17 hermodelleren. Geactiveerde VICs kunnen overgaan in verkalkende cellen die doet denken aan de differentiatie van een mesenchymale stamcel (MSC) in een osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Verkalking lijkt in de collageenrijke fibrosalaag te initiëren uit bijdragen van zowel VEC’s als VIC’s, maar breidt zich uit en dringt de andere lagen van de folderbinnen 8. Het is dus duidelijk dat zowel VEC’s als VIC’s reageren op stimuli om de expressie van osteogene genen te upreguleren, maar de precieze gebeurtenissen die de activering van osteogene genen veroorzaken, evenals het complexe samenspel tussen de cellen en de extracellulaire matrix van de folder, blijven slecht gedefinieerd. Muizenmodellen zijn geen ideale bron om niet-genetische drivers van CAVD-pathogenese te bestuderen, omdat muizen geen CAVD de novo26,27 ontwikkelen, vandaar dat het gebruik van primaire menselijke weefsels en de primaire cellijnen geïsoleerd uit deze weefsels noodzakelijk is. In het bijzonder is het verkrijgen van deze cellen in grote aantallen en van goede kwaliteit noodzakelijk, omdat het veld van 3D-celculturen en organoïde modellering zich uitbreidt en waarschijnlijk een ex vivo op mensen gebaseerd alternatief voor muizenmodellen zal worden.
Het doel van de huidige methode is om een workflow te delen die de voorwaarden heeft vastgesteld om VEC’s en VICs efficiënt te isoleren en te laten groeien die zijn verkregen uit chirurgisch verwijderde kleppen van menselijke donoren. Eerdere studies hebben een succesvolle isolatie van VEC’s en VICs van varkens28 en muizenkleppen29 aangetoond, voor zover wij weten is dit de eerste die de isolatie van deze cellen in menselijke weefsels beschrijft. Het hier beschreven protocol is van toepassing op menselijke weggesneden kleppen en omzeilt en verbetert de schade veroorzaakt door de vaak lange verkrijgingstijd tussen weefselexcisie en laboratoriumverwerking door het gebruik van een koude opslagoplossing te introduceren, een gebufferde oplossing die klinisch wordt gebruikt bij orgaantransplantaties die cellen van het weggesneden weefsel sterk stabiliseert. Het hier beschreven protocol laat ook zien hoe het celfenotype kan worden bepaald en een hoge efficiëntie van celoverleving kan worden gegarandeerd met minimale celkruisbesmetting.
Het verkrijgen van controle- en ziekteweefsels van mensen is van cruciaal belang voor in vitro en ex vivo ziektemodellering; hoewel men vaak spreekt over de uitdagingen van het overbruggen van de kloof tussen bank naar bed, is de omgekeerde volgorde – van de chirurgische suite naar de bank – vaak net zo ontmoedigend een kloof. Essentieel voor een basiswetenschapper om primaire menselijke weefselmonsters te verkrijgen, is een samenwerking met een geïnvesteerde chirurg-wetenschapper die een team van verpleegkundigen, chir…
The authors have nothing to disclose.
We willen Jason Dobbins bedanken voor de inzichtelijke discussie en het kritisch lezen van dit manuscript. We willen het Center for Organ Recovery and Education bedanken voor hun hulp en steun en bedanken weefseldonoren en hun families voor het mogelijk maken van deze studie. Alle patiëntmonsters worden verzameld van personen die zijn ingeschreven voor studies die zijn goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van de Universiteit van Pittsburgh in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Cadaverische weefsels verkregen via het Center for Organ Recovery and Education (CORE) werden goedgekeurd door het University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).
Enkele figuren gemaakt met Biorender.com.
CSH wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 en R01 HL142932, de American Heart Association 20IPA35260111.
0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |