Isolamento de Células Valvares Primárias Humanas para Modelagem de Doenças In Vitro
Summary
Este protocolo descreve a coleta de valvas aórticas humanas extraídas durante procedimentos cirúrgicos de substituição valvar aórtica ou de tecido cadavérico e o subsequente isolamento, expansão e caracterização de células endoteliais e intersticiais valvares primárias específicas do paciente. Estão incluídos detalhes importantes sobre os processos necessários para garantir a viabilidade celular e a especificidade do fenótipo.
Abstract
A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) está presente em quase um terço da população idosa. O espessamento, o enrijecimento e a calcificação da válvula aórtica causam estenose aórtica e contribuem para a insuficiência cardíaca e o acidente vascular cerebral. A patogênese da doença é multifatorial, e estresses como inflamação, remodelamento da matriz extracelular, fluxo turbulento e estresse mecânico e deformação contribuem para a diferenciação osteogênica das células endoteliais e intersticiais valvares. No entanto, os fatores iniciais precisos que impulsionam a transição osteogênica de uma célula saudável para uma célula calcificante não estão totalmente definidos. Além disso, a única terapia atual para estenose aórtica induzida por CAVD é a substituição da válvula aórtica, pela qual a válvula nativa é removida (substituição cirúrgica da válvula aórtica, SAVR) ou uma válvula de substituição totalmente dobrável é inserida através de um cateter (substituição da válvula aórtica transcateter, TAVR). Esses procedimentos cirúrgicos têm um alto custo e com sérios riscos; portanto, a identificação de novos alvos terapêuticos para a descoberta de medicamentos é imperativa. Para esse fim, o presente estudo desenvolve um fluxo de trabalho em que tecidos removidos cirurgicamente de pacientes e tecidos de cadáveres de doadores são usados para criar linhas primárias específicas do paciente de células valvares para modelagem de doenças in vitro. Este protocolo introduz a utilização de uma solução de armazenamento a frio, comumente utilizada no transplante de órgãos, para reduzir os danos causados pelo tempo de captação muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, com o benefício de estabilizar grandemente as células do tecido excisado. Os resultados do presente estudo demonstram que as células valvares isoladas retêm sua capacidade proliferativa e fenótipos endoteliais e intersticiais em cultura mais de vários dias após a retirada valvar do doador. O uso desses materiais permite a coleta de células de controle e CARD, a partir das quais as linhagens celulares de controle e doença são estabelecidas.
Introduction
A valvopatia aórtica calcifica (CAVD) é uma patologia crônica caracterizada por inflamação, fibrose e macrocalcificação dos folhetos valvares aórticos. O remodelamento progressivo e a calcificação dos folhetos (denominada esclerose aórtica) podem levar à obstrução do fluxo sanguíneo (estenose aórtica), o que contribui para o acidente vascular cerebral e leva à insuficiência cardíaca. Atualmente, o único tratamento para CAVD é a substituição cirúrgica ou transcateter da valva aórtica (SAVR e TAVR, respectivamente). Não há opção não cirúrgica para interromper ou reverter a progressão da DAV, e sem a troca valvar, as taxas de mortalidade se aproximam de 50% dentro de 2-3 anos 1,2,3. Definir os mecanismos subjacentes que impulsionam esta patologia identificará potenciais novas abordagens terapêuticas.
Em um adulto saudável, os folhetos valvares aórticos têm aproximadamente um milímetro de espessura, e sua principal função é manter o fluxo unidirecional de sangue para fora do ventrículo esquerdo4. Cada um dos três folhetos é composto por uma camada de células endoteliais da válvula (VECs) que reveste a superfície externa do folheto e funciona como uma barreira. Os VECs mantêm a homeostase valvar regulando a permeabilidade, a adesão das células inflamatórias e a sinalização parácrina 5,6,7. As células intersticiais valvares (VICs) compreendem a maioria das células dentro do folheto valvar8. Os VICs estão dispostos em três camadas distintas no folheto. Essas camadas são conhecidas como ventricular, espongiosa e fibrosa9. O ventricular está voltado para o ventrículo esquerdo e contém fibras de colágeno e elastina. A camada intermediária, a espongiosa, contém alto teor de proteoglicanos que proporciona flexibilidade de cisalhamento durante o ciclo cardíaco. A camada externa de fibrosa está localizada próxima à superfície de saída no lado aórtico e é rica em colágeno fibrilar Tipo I e Tipo III, que fornecem força para manter a coaptação durante a diástole10,11,12. As VICs residem em estado quiescente, no entanto, fatores como inflamação, remodelamento da matriz extracelular (MEC) e estresse mecânico podem interromper a homeostase da CIV 8,9,13,14,15,16. Com a perda da homeostase, os VICs ativam e adquirem um fenótipo semelhante ao miofibroblasto capaz de proliferação, contração e secreção de proteínas que remodelam o milieu extracelular17. VICs ativadas podem fazer a transição para células calcificantes que lembram a diferenciação de uma célula-tronco mesenquimal (CTM) em um osteoblasto 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
A calcificação parece iniciar-se na camada fibrosa rica em colágeno a partir de contribuições de VECs e VICs, mas se expande e invade as demais camadas do folheto8. Assim, fica claro que tanto os VECs quanto os VICs respondem a estímulos para regular positivamente a expressão de genes osteogênicos, no entanto, os eventos precisos que impulsionam a ativação de genes osteogênicos, bem como a complexa interação entre as células e a matriz extracelular do folheto, permanecem mal definidos. Os modelos murinos não são uma fonte ideal para estudar os fatores não genéticos da patogênese da DACD, pois camundongos não desenvolvem CAVD de novo26,27, portanto, o uso de tecidos humanos primários e das linhagens celulares primárias isoladas desses tecidos é necessário. Em particular, a obtenção dessas células em grande número e boa qualidade é imperativa, pois o campo das culturas de células 3D e modelagem organoide está se expandindo e provavelmente se tornará uma alternativa humana ex vivo aos modelos murinos.
O objetivo do presente método é compartilhar um fluxo de trabalho que estabeleceu as condições para isolar e cultivar de forma eficiente VECs e VICs obtidos de válvulas removidas cirurgicamente de doadores humanos. Estudos anteriores mostraram o isolamento bem-sucedido de VECs e VICs de válvulas suínas28 e murinas29, até onde sabemos, este é o primeiro a descrever o isolamento dessas células em tecidos humanos. O protocolo descrito aqui é aplicável a válvulas excisadas humanas e contorna e melhora grandemente os danos causados pelo tempo de colheita muitas vezes longo entre a excisão do tecido e o processamento laboratorial, introduzindo a utilização de uma solução de armazenamento a frio, uma solução tamponada clinicamente utilizada em transplantes de órgãos que estabiliza grandemente as células do tecido excisado. O protocolo aqui descrito também mostra como determinar o fenótipo celular e garantir alta eficiência da sobrevivência celular com o mínimo de contaminação cruzada celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
A obtenção de tecidos de controle e doenças de seres humanos é fundamental para a modelagem de doenças in vitro e ex vivo; no entanto, enquanto muitas vezes se fala sobre os desafios de preencher a lacuna entre o banco à beira do leito, a ordem inversa – indo da suíte cirúrgica para o banco – é muitas vezes tão assustadora quanto uma lacuna. Essencial para um cientista básico obter espécimes de tecido humano primário é uma colaboração com um cientista cirurgião investido que tem uma equipe de enfermeiros…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Jason Dobbins pela discussão perspicaz e leitura crítica deste manuscrito. Gostaríamos de agradecer ao Centro de Recuperação e Educação de Órgãos por sua ajuda e apoio e agradecer aos doadores de tecidos e suas famílias por tornar este estudo possível. Todas as amostras de pacientes são coletadas de indivíduos inscritos em estudos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh, de acordo com a Declaração de Helsinque. Os tecidos cadavéricos obtidos através do Centro de Recuperação e Educação de Órgãos (CORE) foram aprovados pelo Comitê de Supervisão de Pesquisa e Treinamento Clínico Envolvendo Decedentes da Universidade de Pittsburgh (CORID).
Algumas figuras criadas com Biorender.com.
O CSH é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 e R01 HL142932, pela American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Riferimenti
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