Isolering av humana primära ventilceller för in vitro-sjukdomsmodellering
Summary
Detta protokoll beskriver insamlingen av humana aortaklaffar extraherade under kirurgiska aortaklaffersättningsprocedurer eller från kadavervävnad, och efterföljande isolering, expansion och karakterisering av patientspecifika primära ventilendotel- och interstitiella celler. Inkluderat är viktiga detaljer om de processer som behövs för att säkerställa cellviabilitet och fenotypspecificitet.
Abstract
Calcific aortaklaffsjukdom (CAVD) finns i nästan en tredjedel av den äldre befolkningen. Förtjockning, förstyvning och förkalkning av aortaklaffen orsakar aortastenos och bidrar till hjärtsvikt och stroke. Sjukdomspatogenes är multifaktoriell, och spänningar som inflammation, extracellulär matrisombyggnad, turbulent flöde och mekanisk stress och belastning bidrar till osteogen differentiering av ventilendotel- och ventilinterstitiella celler. De exakta initieringsfaktorerna som driver den osteogena övergången av en frisk cell till en förkalkande cell är dock inte helt definierade. Vidare är den enda nuvarande behandlingen för CAVD-inducerad aortastenos aortaklaffbyte, varigenom den ursprungliga ventilen avlägsnas (kirurgisk aortaklaffbyte, SAVR) eller en helt hopfällbar ersättningsventil sätts in via en kateter (transkateter aortaklaffbyte, TAVR). Dessa kirurgiska ingrepp kommer till en hög kostnad och med allvarliga risker; Därför är det absolut nödvändigt att identifiera nya terapeutiska mål för läkemedelsupptäckt. För detta ändamål utvecklar den aktuella studien ett arbetsflöde där kirurgiskt borttagna vävnader från patienter och donatorkadavervävnader används för att skapa patientspecifika primära linjer av klaffceller för in vitro-sjukdomsmodellering. Detta protokoll introducerar användningen av en kylförvaringslösning, som vanligtvis används vid organtransplantation, för att minska skadorna som orsakas av den ofta långa tillvaratagandetiden mellan vävnadsexcision och laboratoriebearbetning med fördelen av kraftigt stabiliserande celler i den utskurna vävnaden. Resultaten av den aktuella studien visar att isolerade ventilceller behåller sin proliferativa kapacitet och endotel- och interstitiella fenotyper i odling uppemot flera dagar efter ventilavlägsnande från givaren. Genom att använda dessa material möjliggörs insamling av kontroll- och CAVD-celler, från vilka både kontroll- och sjukdomscellinjer är etablerade.
Introduction
Calcific aortaklaffsjukdom (CAVD) är en kronisk patologi som kännetecknas av inflammation, fibros och makroförkalkning av aortaklaffblad. Progressiv ombyggnad och förkalkning av broschyrerna (kallad aortaskleros) kan leda till obstruktion av blodflödet (aortastenos) vilket bidrar till stroke och leder till hjärtsvikt. För närvarande är den enda behandlingen för CAVD kirurgisk eller transkateter aortaklaffbyte (SAVR respektive TAVR). Det finns inget icke-kirurgiskt alternativ för att stoppa eller vända CABD-progressionen, och utan ventilbyte närmar sig dödligheten 50% inom 2-3 år 1,2,3. Att definiera de underliggande mekanismerna som driver denna patologi kommer att identifiera potentiella nya terapeutiska tillvägagångssätt.
Hos en frisk vuxen är aortaklaffbladen ungefär en millimeter tjocka, och deras huvudsakliga funktion är att upprätthålla det enkelriktade blodflödet ut ur vänster ventrikel4. Var och en av de tre broschyrerna består av ett lager av ventilendotelceller (VEC) som kantar bipacksedelns yttre yta och fungerar som en barriär. VEC upprätthåller ventilhomeostas genom att reglera permeabilitet, inflammatorisk celladhesion och parakrin signalering 5,6,7. Ventilinterstitiella celler (VICs) utgör majoriteten av cellerna i ventilbroschyren8. VICs är ordnade i tre distinkta lager i bipacksedeln. Dessa lager är kända som ventricularis, spongiosa och fibrosa9. Ventricularis vetter mot vänster kammare och innehåller kollagen och elastinfibrer. Mellanskiktet, spongiosa, innehåller högt proteoglykaninnehåll som ger skjuvflexibilitet under hjärtcykeln. Det yttre fibrosaskiktet ligger nära utflödesytan på aortasidan och är rikt på typ I och typ III fibrillärt kollagen som ger styrka för att upprätthålla koaptation under diastol10,11,12. VICs ligger i vilande tillstånd, men faktorer som inflammation, ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM) och mekanisk stress kan störa VIC-homeostas 8,9,13,14,15,16. Med förlust av homeostas aktiverar och förvärvar VICs en myofibroblastliknande fenotyp som kan proliferera, sammandragning och utsöndring av proteiner som omformar den extracellulära millieu17. Aktiverade VICs kan övergå till förkalkande celler som påminner om differentieringen av en mesenkymal stamcell (MSC) till en osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Förkalkning verkar initieras i det kollagenrika fibrosaskiktet från bidrag från både VEC och VICs men expanderar och invaderar de andra lagren i bipacksedeln8. Således är det uppenbart att både VEC och VICs svarar på stimuli för att upregulate uttrycket av osteogena gener, men de exakta händelserna som driver aktiveringen av osteogena gener, liksom det komplexa samspelet mellan cellerna och bipacksedelns extracellulära matris, förblir dåligt definierade. Murinmodeller är inte en idealisk källa för att studera icke-genetiska drivkrafter för CABD-patogenes, eftersom möss inte utvecklar CAVD de novo26,27, varför användningen av primära mänskliga vävnader och de primära cellinjerna isolerade från dessa vävnader är nödvändig. I synnerhet är det absolut nödvändigt att erhålla dessa celler i stort antal och god kvalitet, eftersom fältet för 3D-cellkulturer och organoidmodellering expanderar och sannolikt kommer att bli ett ex vivo människobaserat alternativ till murina modeller.
Syftet med den nuvarande metoden är att dela ett arbetsflöde som har etablerat förutsättningarna för att effektivt isolera och odla VEC och VICs erhållna från kirurgiskt borttagna ventiler från mänskliga givare. Tidigare studier har visat framgångsrik isolering av VEC och VIC från svin28 och murina ventiler29, vad vi vet är detta den första som beskriver isoleringen av dessa celler i mänskliga vävnader. Protokollet som beskrivs här är tillämpligt på mänskliga utskurna ventiler och kringgår och förbättrar kraftigt skadorna som orsakas av den ofta långa tillvaratagandetiden mellan vävnadsexcision och laboratoriebearbetning genom att införa användningen av en kylförvaringslösning, en buffrad lösning som kliniskt används vid organtransplantationer som kraftigt stabiliserar cellerna i den utskurna vävnaden. Protokollet som beskrivs här visar också hur man bestämmer cellfenotyp och garanterar hög effektivitet för cellöverlevnad med minimal cellkorskontaminering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att erhålla kontroll- och sjukdomsvävnader från människor är avgörande för in vitro- och ex vivo-sjukdomsmodellering; Men medan man ofta talar om utmaningarna med att överbrygga klyftan mellan bänk och säng, är den omvända ordningen – att gå från operationssviten till bänken – ofta lika skrämmande en lucka. Viktigt för en grundläggande forskare att få primära mänskliga vävnadsprover är ett samarbete med en investerad kirurgforskare som har ett team av sjuksköterskor, kirurgiska tekniker, läkarass…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Jason Dobbins för insiktsfull diskussion och kritisk läsning av detta manuskript. Vi vill uppmärksamma Center for Organ Recovery and Education för deras hjälp och stöd och tacka vävnadsdonatorer och deras familjer för att ha gjort denna studie möjlig. Alla patientprover samlas in från personer som deltar i studier som godkänts av den institutionella granskningsnämnden vid University of Pittsburgh i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Kadaveriska vävnader som erhållits via Center for Organ Recovery and Education (CORE) godkändes av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).
Några figurer skapade med Biorender.com.
CSH stöds av National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 och R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
Riferimenti
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment–insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells – A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
