마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식
Summary
여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.
Abstract
T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, 세포독성 T 림프구 (CTLs)는 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 기원 및 보충은 모호한 채로 남아있다. 이 프로토콜은 대리 신항원, 난알부민 (OVA) 및 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스를 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주를 채용하며, 여기서 CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA 257-264 (SIINFEKL)를 특이적으로 인식한다. 이러한 특징들은 종양발생 동안 항원-특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다.
이 모델을 종양 이식 수술과 결합하여, 기증자의 종양 조직을 종양과 일치하는 합성 수용자 마우스에 이식하여 이식된 기증자 조직으로의 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하여, 종양 고유 및 주변부 기원 항원 특이적 CD8+ 의 면역 반응을 분석할 수 있게 하였다. T 세포. 이 두 집단 사이에서 역동적 인 전환이 일어나는 것으로 나타났습니다. 총체적으로,이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정확하게 조사하기위한 또 다른 접근법을 제공했으며, 이는 종양 면역학에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.
Introduction
CD8+ T 세포-매개 면역 반응은 종양 성장을 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 종양 생성 동안, 나이브 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I-제한 방식으로 항원 인식시 활성화되고, 이어서 이펙터 세포로 분화되고 종양 질량 1,2로 침윤된다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내에서, 장기간의 항원 노출, 뿐만 아니라 면역억제 인자는, 침윤된 종양 특이적 CD8+ T 세포를 “고갈”3으로 알려진 저반응 상태로 유도한다. 고갈된 T 세포 (Tex)는 급성 바이러스 감염에서 생성된 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되며, 전사적으로 및 후성유전학적으로 둘 다이다. 이들 텍스 세포는 주로 일련의 억제 수용체의 지속적이고 상승된 발현뿐만 아니라 이펙터 기능의 계층적 손실을 특징으로 한다. 또한, 소진된 CD8+ T 세포의 손상된 증식 능력은 종양 특이적 T 세포의 수의 감소를 초래하여, TME 내의 잔류 CD8+ T 세포가 종양 진행에 대해 충분한 보호 면역을 간신히 제공할 수 있다3. 따라서, 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유지 또는 강화는 종양 억제에 필수적이다.
더욱이, 면역 체크포인트 봉쇄 (ICB) 요법은 T 세포 침윤을 증가시킴으로써 종양에서 텍스를 다시 활성화시키고, 따라서, T 세포 수 및 회춘 T 세포 기능을 활성화시켜 종양 억제를 증진시키는 것으로 여겨진다. ICB 치료의 광범위한 적용은 암 치료 환경을 변화시켰으며, 환자의 상당 부분이 내구성 있는 반응을 경험하고있다 4,5,6. 그럼에도 불구하고, 대부분의 환자와 암 유형은 ICB에 일시적으로 반응하지 않거나 단지 일시적으로 반응한다. TME에서의 부적절한 T 세포 침윤은 ICB 내성 7,8을 차지하는 근본적인 메카니즘 중 하나로 가정되었다.
몇몇 연구는 환자 및 마우스 모델 9,10,11,12 모두에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포 (TILs)의 이질성을 입증하였다. 종양 덩어리에서 T 세포 인자-1 (TCF1)을 발현하는 CD8+ T 세포의 서브세트가 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 말기 소모 된 T 세포를 더 일으킬 수 있으며 ICB 치료 후 증식 파열을 담당합니다 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22년. 그러나, 항원 특이적 TCF1+CD8+ T 세포의 단지 작은 비율만이 TME에 존재하고, ICB23,24,25,26에 반응하여 분화된 자손의 확장된 풀을 생성한다는 것이 입증되었다. 이 집단의 제한된 크기가 종양 진행을 조절하기 위해 세포독성 T 림프구 (CTLs)의 지속성을 보장하기에 충분한지 여부는 알려지지 않았으며, 주변 조직으로부터 보충이 있는지 여부는 추가 조사가 필요하다. 더욱이, 최근의 연구는 기존의 종양 특이적 T 세포의 불충분한 활성화 능력 및 항프로그램된 세포 사멸 단백질 1 처리 후에 신규한, 이전에 존재하지 않는 클론형의 출현을 시사한다. 이는 체크포인트 차단에 대한 T 세포 반응이 T 세포 클론(27)의 별개의 레퍼토리의 새로운 유입에 기인할 수 있음을 나타낸다. TME에서 방관자 비종양 반응성 세포독성 T 세포 분획의 존재와 함께, 이러한 발견은 주변부 유래 CD8+ T 세포11의 역할을 연구하기 위한 종양 동종이식편 모델의 확립을 촉발시켰다.
지금까지, 여러 종류의 종양 이식뿐만 아니라 면역 세포 입양 전달이 종양 면역학28 분야에서 널리 사용되어 왔다. TILs, 말초 혈액 단핵 세포, 및 종양-반응성 면역 세포는 다른 조직으로부터 기원된 이들 방법을 사용하여 잘 특성화될 수 있다. 그러나, 전신 및 국소 항종양 면역 사이의 상호작용을 연구할 때, 이들 모델은 주변부와 TME로부터 유래된 면역 세포 사이의 상호작용을 조사하기에 부적합한 것으로 보인다. 여기서, 종양 조직을 공여자로부터 종양 매칭 수용자 마우스로 이식하여 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하고 TME에서 공여체 유래 세포를 동시에 관찰하였다.
본 연구에서, 대리 신항원 난알부민을 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주와 함께 흑색종의 뮤린 신생 모델이 확립되었다. CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I MHC 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA257-264(SIINFEKL)를 특이적으로 인식하는 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스는 B16F10-OVA 종양 모델에서 개발된 항원 특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다. 이 모델을 종양 이식과 결합하여, 종양-고유 및 주변-기원 항원-특이적 CD8+ T 세포의 면역 반응을 비교하여, 이들 두 집단 사이의 동적 전이를 드러냈다. 총체적으로, 이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 또 다른 접근법을 제공하였고, 이는 TME에서 종양 특이적 T 세포 면역 반응의 역학에 대한 새로운 빛을 발산한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, CTL은 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, TME 내의 종양 항원-특이적 CTLs의 기원은 해명되지 않았다(30). 이러한 종양 이식 프로토콜의 사용은 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포가 줄기-유사 TCF1+ 전구 CD8+ T 세포의 존재에도 불구하고 오랫동안 지속되지 않을 수 있다는 중요한 단서?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 저명한 젊은 학자를위한 국립 자연 과학 기금 (31825011 번에서 LY)과 중국 국립 자연 과학 재단 (QH에 31900643 번, ZW에 31900656 번)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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