Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.
Abstract
A imunidade mediada por células T desempenha um papel crucial nas respostas imunes contra tumores, com linfócitos T citotóxicos (CTLs) desempenhando o papel principal na erradicação das células cancerosas. No entanto, as origens e a reposição das células CD8+ T específicas do antígeno tumoral dentro do microambiente tumoral (TME) permanecem obscuras. Este protocolo emprega a linha celular de melanoma B16F10-OVA, que expressa de forma estável os camundongos substitutos neoantígeno, ovalbumin (OVA) e TCR transgênicos OT-I, nos quais mais de 90% das células T CD8+ reconhecem especificamente o peptídeo derivado do OVA OVA257-264 (SIINFEKL) ligado à molécula H2-K(S2-K) do complexo de histocompatibilidade (MHC) da classe I. Essas características permitem o estudo de respostas de células T específicas de antígeno durante a tumorigênese.
Combinando este modelo com a cirurgia de transplante de tumores, os tecidos tumorais de doadores foram transplantados em camundongos receptores sinénicos compatíveis com tumores para rastrear precisamente o fluxo de células imunes derivadas do receptor em tecidos transplantados, permitindo a análise das respostas imunes do CD8+ específico para o tumor e da periferia. Células T. Verificou-se uma transição dinâmica entre essas duas populações. Coletivamente, este design experimental forneceu outra abordagem para investigar com precisão as respostas imunes das células T CD8+ em TME, o que lançará uma nova luz sobre a imunologia tumoral.
Introduction
A resposta imune mediada por células T CD8+ desempenha um papel fundamental no controle do crescimento do tumor. Durante a tumorigênese, as células T CD8+ ingênuas são ativadas no reconhecimento de antígeno de forma restrita à classe I do MHC e, posteriormente, se diferenciam em células efetivas e se infiltram na massa tumoral 1,2. No entanto, dentro do microambiente tumoral (TME), exposição prolongada ao antígeno, bem como fatores imunossupressores, conduzem células CD8+ T específicas do tumor infiltradas em um estado hiporesponsivo conhecido como “exaustão”3. As células T exaustas (Tex) são distintas das células T de efeito ou memória geradas em infecção viral aguda, tanto transcrição quanto epigeneticamente. Estas células Tex são caracterizadas principalmente pela expressão sustentada e elevada de uma série de receptores inibitórios, bem como pela perda hierárquica das funções de efeitos. Além disso, a capacidade proliferativa prejudicada de células T CD8+ esgotadas resulta na diminuição do número de células T específicas do tumor, de tal forma que as células T cd8+ residuais dentro do TME mal podem fornecer imunidade protetora suficiente contra a progressão do tumor3. Assim, a manutenção ou reforço das células CD8+ T específicas do antígeno intratumoral é indispensável para a repressão tumoral.
Além disso, acredita-se que a terapia de bloqueio de ponto de verificação imunológica (ICB) revigore Tex em tumores, aumentando a infiltração de células T e, portanto, o número de células T e rejuvenescendo as funções celulares T para aumentar a repressão tumoral. A aplicação generalizada do tratamento de ICB mudou o cenário da terapia oncológica, com um subconjunto substancial de pacientes experimentando respostas duráveis 4,5,6. No entanto, a maioria dos pacientes e tipos de câncer não respondem ou apenas temporariamente ao ICB. A infiltração inadequada de células T no TME foi postulada como um dos mecanismos subjacentes que explicam a resistência ao ICB 7,8.
Vários estudos demonstraram a heterogeneidade das células T CD8+ (TILs) infiltradas em tumores em ambos os pacientes e modelos de camundongos 9,10,11,12. Foi confirmado que um subconjunto de células T CD8+ expressando fator T celular-1 (TCF1) em uma massa tumoral exibe propriedades semelhantes a células-tronco, o que poderia ainda dar origem a células T terminais e é responsável pela explosão de proliferação após a terapia icb 12,13,14,15,16,17,18, 19,20, 21,22. No entanto, foi comprovado que apenas uma pequena proporção de células TCF1+CD8+ específicas de antígenos existem no TME e geram um pool expandido de descendência diferenciada em resposta ao ICB 23,24,25,26. Se o tamanho limitado dessa população é suficiente para garantir a persistência dos linfócitos T citotóxicos (CTLs) para controlar a progressão do tumor permanece desconhecido, e se há reposição dos tecidos da periferia requer uma investigação mais aprofundada. Além disso, pesquisas recentes sugerem a capacidade de revigoração insuficiente de células T pré-existentes específicas do tumor e o aparecimento de clonótipos novos, anteriormente não existentes após o tratamento da proteína de morte celular anti-programada 1. Isso indica que a resposta da célula T ao bloqueio de ponto de verificação pode ser devido ao novo fluxo de um repertório distinto de clones de células T27. Juntamente com a presença de uma fração de célula t citotóxica não-tumora-reativa no TME, esses achados levaram o estabelecimento de um modelo de aoentrato tumoral para estudar o papel das células T CD8+ derivadas da periferia11.
Até agora, vários tipos de implantação tumoral, bem como transferência de células imunes, têm sido amplamente utilizados no campo da imunologia tumoral28. TILs, células mononucleares de sangue periféricos e células imunes tumorais reativas originárias de outros tecidos podem ser bem caracterizados usando esses métodos. No entanto, ao estudar as interações entre imunidade antitumor sistêm e local, esses modelos parecem inadequados para examinar as interações entre células imunes derivadas da periferia e do TME. Aqui, os tecidos tumorais foram transplantados de doadores em camundongos receptores compatíveis com tumores para rastrear precisamente o fluxo de células imunes derivadas do receptor e observar as células derivadas do doador no TME concomitantemente.
Neste estudo, foi estabelecido um modelo síngênico de melanoma murina com a linha celular de melanoma B16F10-OVA, que expressa a facadas o ovalbumina neoantígeno substituto. Camundongos OT-I transgênicos TCR, nos quais mais de 90% das células T CD8+ reconhecem especificamente o peptídeo derivado de OVA OVA257-264 (SIINFEKL) ligado à molécula classe I MHC H2-Kb, permitem o estudo de respostas de células T específicas de antígeno desenvolvidas no modelo de tumor B16F10-OVA. Combinando esse modelo com o transplante de tumores, as respostas imunes das células CD8+ T específicas do tumor e da periferia foram comparadas para revelar uma transição dinâmica entre essas duas populações. Coletivamente, este design experimental forneceu outra abordagem para investigar precisamente as respostas imunes das células T CD8+ no TME, o que lança uma nova luz sobre a dinâmica das respostas imunes de células T específicas do tumor no TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imunidade mediada por células T desempenha um papel crucial nas respostas imunes contra tumores, com as CTLs desempenhando o papel principal na erradicação das células cancerosas. No entanto, as origens das TCS específicas do antígeno tumor dentro da TME não foram elucidadas30. O uso deste protocolo de transplante de tumores forneceu uma pista importante de que as células T CD8+ específicas do antígeno intratumoral podem não persistir por muito tempo, apesar da existência …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado por subsídios do National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) e da National Natural Science Foundation of China (No. 31900643 para QH, No. 31900656 à ZW).
Materials
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL tuberculin syringe | KDL | BB000925 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16F10-OVA cell line | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone:104 |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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