Generation av 3D Hela Lungorganoider från inducerade pluripotenta stamceller för modellering av lungutvecklingsbiologi och sjukdom
Summary
Artikeln beskriver steg klokt riktade differentiering av inducerade pluripotenta stamceller till tredimensionella hela lung organoider som innehåller både proximal och distala epitelial lungceller tillsammans med mesenchyme.
Abstract
Mänsklig lungutveckling och sjukdom har varit svår att studera på grund av bristen på biologiskt relevanta in vitro-modellsystem . Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) kan differentieras stegvis i 3D multicellulära lungorganoider, gjorda av både epitelial och mesenchymala cellpopulationer. Vi rekapitulerar embryonala utvecklingsmässiga ledtrådar genom att tidsmässigt införa en mängd olika tillväxtfaktorer och små molekyler för att effektivt generera slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och därefter lung stamceller. Dessa celler är sedan inbäddade i tillväxtfaktor reducerad (GFR)-källare membranmatris medium, så att de spontant kan utvecklas till 3D lungorganoider som svar på externa tillväxtfaktorer. Dessa hela lungorganoider (WLO) genomgår tidiga lungutvecklingsstadier inklusive förgrening av morfenes och mognad efter exponering för dexametason, cyklisk AMP och isobutylxanthine. WLOs har luftvägsepitetelceller som uttrycker markörerna KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubba) och MUC5AC (bägare) samt alveolar epitelceller som uttrycker HOPX (alveolar typ I) och SP-C (alveolar typ II). Mesenkymala celler finns också, inklusive glatt muskelaktin (SMA) och trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptor A (PDGFRα). iPSC-härledda WLOs kan bibehållas under 3D-odlingsförhållanden i många månader och kan sorteras för ytmarkörer för att rena en viss cellpopulation. iPSC härledda WLOs kan också användas för att studera mänsklig lungutveckling, inklusive signalering mellan lungepitelet och mesenkym, för att modellera genetiska mutationer på människans lungcellsfunktion och utveckling och för att bestämma cytotoxiciteten hos smittsamma medel.
Introduction
Lungan är ett komplicerat, heterogent, dynamiskt organ som utvecklas i sex distinkta stadier – embryonala, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar och mikrovaskulära mognad1,2. De två senare faserna förekommer pre och postnatally i mänsklig utveckling medan de första fyra stadierna inträffar uteslutande under fetala utveckling om inte prematur födsel inträffar3. Den embryonala fasen börjar i det endodermala bakterieskiktet och avslutas med att luftstrupen och lungknopparna spirar. Lungutveckling sker delvis via signalering mellan epitelial och mesenkymala celler4. Dessa interaktioner resulterar i lung förgrening, spridning, cellulär ödebestämning och cellulär differentiering av den utvecklande lungan. Lungan är indelad i ledande zoner (luftstrupe till de terminala bronkiolerna) och andningszoner (respiratoriska bronkioler till alveolerna). Varje zon innehåller unika epitelcelltyper. inklusive basala, sekretoriska, ciliated, borste, neuroendokrina och jonocytceller i den ledande luftvägarna5, följt av alveolar typ I och II celler i luftvägarna epitel6. Mycket är fortfarande okänt om utvecklingen och svaret på skador av de olika celltyperna. iPSC härledda lungorganoidmodeller möjliggör studier av mekanismer som driver mänsklig lungutveckling, effekterna av genetiska mutationer på lungfunktionen och svaret från både epitel och mesenkime på smittämnen utan behov av primär mänsklig lungvävnad.
Markörer som motsvarar de olika stadierna av embryonal differentiering inkluderar CXCR4, cKit, FOXA2 och SOX17 för slutgiltig endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 och SOX2 för främre foregut endoderm (AFE)8 och NKX2-1 för tidiga lungprogenitorceller9. I embryonal lungutveckling delar foreguten in i dorsala matstrupen och ventrala luftstrupen. Knopparna i höger och vänster lungor visas som två oberoende utpouchings runt trakeal knopp10. Under förgrening morphogenesis producerar mesenkymen som omger epitelet elastisk vävnad, glatt muskel, brosk och vaskulatur11. Interaktionen mellan epitel och mesenchyme är avgörande för normal lungutveckling. Detta inkluderar utsöndringen av FGF1012 av mesenchymen och SHH13 som produceras av epitelet.
Här beskriver vi ett protokoll för riktad differentiering av hiPSCs till tredimensionella (3D) hela lungorganoider (WLO). Medan det finns liknande metoder som införlivar isolering av lungprogenitorceller via sortering på LPC-stadiet för att göra alveolarliknande 14,15 (distala) organoider eller luftvägsceller16 (proximala) organoider, eller generera ventral-främre foregut-sfäroider för att göra mänskliga lungorganoider som uttrycker alveolarcell- och mesenkymala markörer och knoppspetsprogenitororganoider17 , styrkan i denna metod är införandet av både lung epitelial och mesenchymal celltyper att mönster och orkestrera lunggrenande morfogogenes, mognad och expansion in vitro.
Detta protokoll använder små molekyler och tillväxtfaktorer för att styra differentiering av pluripotenta stamceller genom slutgiltig endoderm, främre foregut endoderm och lung stamceller. Dessa celler induceras sedan till 3D hela lungorganoider genom viktiga utvecklingssteg, inklusive förgrening och mognad. Sammanfattningen av differentieringsprotokollet visas i figur 1a med representativa brightfieldbilder av endodermal och organoid differentiering som visas i figur 1b. Figur 1c,d visar genuttryck detaljer om endodermal differentiering samt genuttryck av både proximala och distala populationer av lung epitelial celler efter avslutad differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den framgångsrika differentieringen av 3D hela lungorganoider (WLO) förlitar sig på ett 6-veckors protokoll i flera steg med uppmärksamhet på detaljer, inklusive tid för exponering för tillväxtfaktorer och små molekyler, cellulär densitet efter passaging och kvaliteten på hiPSCs. Felsökning finns i tabell 2. hiPSCs bör vara cirka 70-80% confluent, med mindre än 5% spontan differentiering före dissociation. Detta protokoll kräver “mTeSR plus” medium; Emellertid, vanliga “mTeSR” medium har …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Riferimenti
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Biologia dello sviluppo. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
