Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit
Summary
Der Artikel beschreibt die schrittweise gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zu dreidimensionalen ganzen Lungenorganoiden, die sowohl proximale als auch distale epitheliale Lungenzellen zusammen mit Mesenchym enthalten.
Abstract
Die Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Lunge war aufgrund des Mangels an biologisch relevanten In-vitro-Modellsystemen schwer zu untersuchen. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) können schrittweise in mehrzellige 3D-Lungenorganoide differenziert werden, die sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Zellpopulationen bestehen. Wir rekapitulieren embryonale Entwicklungssignale, indem wir zeitlich eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen einführen, um effizient definitive Endoderm-, anteriore Vorderdarm-Endoderm- und anschließend Lungen-Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Zellen werden dann in ein wachstumsfaktorreduziertes (GFR)-Basalmembranmatrixmedium eingebettet, so dass sie sich als Reaktion auf externe Wachstumsfaktoren spontan zu 3D-Lungenorganoiden entwickeln können. Diese ganzen Lungenorganoide (WLO) durchlaufen frühe Entwicklungsstadien der Lunge, einschließlich verzweigter Morphogenese und Reifung nach Exposition gegenüber Dexamethason, zyklischem AMP und Isobutylxanthin. WLOs besitzen Atemwegsepithelzellen, die die Marker KRT5 (basal), SCGB3A2 (Club) und MUC5AC (Kelch) exprimieren, sowie alveoläre Epithelzellen, die HOPX (alveolarer Typ I) und SP-C (alveolarer Typ II) exprimieren. Mesenchymalzellen sind ebenfalls vorhanden, einschließlich Aktin der glatten Muskulatur (SMA) und des von Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors A (PDGFRα). iPSC-abgeleitete WLOs können unter 3D-Kulturbedingungen für viele Monate aufbewahrt und nach Oberflächenmarkern sortiert werden, um eine bestimmte Zellpopulation zu reinigen. iPSC-abgeleitete WLOs können auch verwendet werden, um die menschliche Lungenentwicklung zu untersuchen, einschließlich der Signalübertragung zwischen dem Lungenepithel und dem Mesenchym, um genetische Mutationen auf die Funktion und Entwicklung menschlicher Lungenzellen zu modellieren und die Zytotoxizität von Infektionserregern zu bestimmen.
Introduction
Die Lunge ist ein kompliziertes, heterogenes, dynamisches Organ, das sich in sechs verschiedenen Stadien entwickelt – embryonaler, pseudoglandulärer, kanalikulärer, sackulärer, alveolärer und mikrovaskulärer Reifung1,2. Die beiden letztgenannten Phasen treten prä- und postnatal in der menschlichen Entwicklung auf, während die ersten vier Phasen ausschließlich während der fetalen Entwicklung auftreten, es sei denn, es tritt eine Frühgeburt auf3. Die embryonale Phase beginnt in der endodermalen Keimschicht und endet mit dem Austrieb der Luftröhre und der Lungenknospen. Die Lungenentwicklung erfolgt zum Teil über die Signalübertragung zwischen den Epithel- und Mesenchymzellen4. Diese Wechselwirkungen führen zu Lungenverzweigung, Proliferation, Bestimmung des zellulären Schicksals und zellulärer Differenzierung der sich entwickelnden Lunge. Die Lunge ist in leitende Zonen (Luftröhre zu den terminalen Bronchiolen) und Atemzonen (respiratorische Bronchiolen zu den Alveolen) unterteilt. Jede Zone enthält einzigartige Epithelzelltypen; einschließlich basaler, sekretorischer, flimmerförmiger, Bürsten-, neuroendokriner und Ionozytenzellen im leitenden Atemweg5, gefolgt von alveolären Typ-I- und -II-Zellen im respiratorischen Epithel6. Über die Entstehung und Reaktion auf Verletzungen der verschiedenen Zelltypen ist noch viel unbekannt. iPSC-abgeleitete Lungenorganoidmodelle ermöglichen die Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung der menschlichen Lunge vorantreiben, der Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Lungenfunktion und der Reaktion sowohl des Epithels als auch des Mesenchyms auf Infektionserreger, ohne dass primäres menschliches Lungengewebe erforderlich ist.
Zu den Markern, die den verschiedenen Stadien der embryonalen Differenzierung entsprechen, gehören CXCR4, cKit, FOXA2 und SOX17 für das definitive Endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 und SOX2 für das vordere Vorderdarmendoderm (AFE)8 und NKX2-1 für frühe Lungenvorläuferzellen9. Bei der embryonalen Lungenentwicklung teilt sich der Vorderdarm in die dorsale Speiseröhre und die ventrale Luftröhre. Die Knospen der rechten und linken Lunge erscheinen als zwei unabhängige Ausscheidungen um die Trachealknospe10. Während der Verzweigung der Morphogenese produziert das Mesenchym, das das Epithel umgibt, elastisches Gewebe, glatte Muskulatur, Knorpel und Gefäßkulatur11. Die Wechselwirkung zwischen Epithel und Mesenchym ist essentiell für eine normale Lungenentwicklung. Dazu gehört die Sekretion von FGF1012 durch das Mesenchym und SHH13, das vom Epithel produziert wird.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gerichteten Differenzierung von hiPS-Zellen in dreidimensionale (3D) ganze Lungenorganoide (WLO). Während es ähnliche Ansätze gibt, die die Isolierung von Lungenvorläuferzellen durch Sortierung im LPC-Stadium beinhalten, um alveolär-ähnliche 14,15 (distale) Organoide oder Atemwege16 (proximale) Organoide herzustellen oder ventral-anteriore Vorderdarm-Sphäroide zu erzeugen, um menschliche Lungenorganoide herzustellen, die alveoläre Zell- und mesenchymale Marker und Knospenspitzen-Vorläuferorganoide exprimieren17 Die Stärke dieser Methode ist die Einbeziehung sowohl von Lungenepithel- als auch von mesenchymalen Zelltypen, um die Morphogenese, Reifung und Expansion der Lunge in vitro zu strukturieren und zu orchestrieren.
Dieses Protokoll verwendet kleine Moleküle und Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen durch definitive Endoderm-, vordere Vorderdarm-Endoderm- und Lungenvorläuferzellen zu steuern. Diese Zellen werden dann durch wichtige Entwicklungsschritte, einschließlich Verzweigung und Reifung, in 3D-Ganze Lungenorganoide induziert. Die Zusammenfassung des Differenzierungsprotokolls ist in Abbildung 1a mit repräsentativen Hellfeldbildern der endodermalen und organoiden Differenzierung in Abbildung 1b dargestellt. Abbildung 1c,d zeigt die Genexpressionsdetails der endodermalen Differenzierung sowie die Genexpression sowohl der proximalen als auch der distalen Populationen von Lungenepithelzellen nach Abschluss der Differenzierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erfolgreiche Differenzierung von 3D-Ganzlungenorganoiden (WLO) beruht auf einem mehrstufigen, 6-wöchigen Protokoll mit Liebe zum Detail, einschließlich der Zeit der Exposition gegenüber Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen, der Zelldichte nach dem Passieren und der Qualität der hiPS-Zellen. Informationen zur Problembehandlung finden Sie in Tabelle 2. hiPS-Zellen sollten etwa 70%-80% konfluent sein, mit weniger als 5% spontaner Differenzierung vor der Dissoziation. Dieses Protokoll erfordert d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) unterstützt.
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Riferimenti
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