मॉडलिंग फेफड़े के विकास जीव विज्ञान और रोग के लिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से 3 डी पूरे फेफड़ों Organoids की पीढ़ी
Summary
लेख में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के चरणवार निर्देशित विभेदन का वर्णन किया गया है जो मेसेनकाइम के साथ-साथ समीपस्थ और डिस्टल उपकला फेफड़ों की कोशिकाओं दोनों से युक्त तीन आयामी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स के लिए होता है।
Abstract
विट्रो मॉडल प्रणालियों में जैविक रूप से प्रासंगिक की कमी के कारण मानव फेफड़ों के विकास और बीमारी का अध्ययन करना मुश्किल हो गया है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSCs) को 3 डी बहुकोशिकीय फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में चरणबद्ध रूप से विभेदित किया जा सकता है, जो उपकला और मेसेनकाइमल सेल आबादी दोनों से बना है। हम अस्थायी रूप से निश्चित एंडोडर्म, पूर्वकाल फोरगट एंडोडर्म, और बाद में फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार के विकास कारकों और छोटे अणुओं को पेश करके भ्रूण विकास के संकेतों को दोहराते हैं। इन कोशिकाओं को तब विकास कारक कम (जीएफआर) -तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम में एम्बेडेड किया जाता है, जिससे उन्हें बाहरी विकास कारकों के जवाब में अनायास 3 डी फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में विकसित करने की अनुमति मिलती है। ये पूरे फेफड़े के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) प्रारंभिक फेफड़ों के विकास के चरणों से गुजरते हैं, जिसमें डेक्सामेथासोन, चक्रीय एएमपी और आइसोब्यूटिलक्सैंथिन के संपर्क में आने के बाद शाखाओं मॉर्फोजेनेसिस और परिपक्वता शामिल है। WLOs के पास वायुमार्ग उपकला कोशिकाएं होती हैं जो मार्करों KRT5 (बेसल), SCGB3A2 (क्लब) और MUC5AC (goblet) के साथ-साथ वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं को व्यक्त करती हैं जो HOPX (वायुकोशीय प्रकार I) और एसपी-सी (वायुकोशीय प्रकार II) को व्यक्त करती हैं। मेसेनकाइमल कोशिकाएं भी मौजूद हैं, जिनमें चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए), और प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर ए (पीडीजीएफआरएक्स) शामिल हैं। iPSC व्युत्पन्न WLOs को कई महीनों तक 3 डी संस्कृति स्थितियों में बनाए रखा जा सकता है और एक विशिष्ट सेल आबादी को शुद्ध करने के लिए सतह मार्करों के लिए क्रमबद्ध किया जा सकता है। आईपीएससी व्युत्पन्न डब्ल्यूएलओ का उपयोग मानव फेफड़ों के विकास का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसमें फेफड़ों के उपकला और मेसेनकाइम के बीच सिग्नलिंग शामिल है, मानव फेफड़ों के सेल फ़ंक्शन और विकास पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए, और संक्रामक एजेंटों की साइटोटॉक्सिसिटी निर्धारित करने के लिए।
Introduction
फेफड़े एक जटिल, विषम, गतिशील अंग है जो छह अलग-अलग चरणों में विकसित होता है – भ्रूण, स्यूडोग्लैंडुलर, कैनेलिकुलर, सैक्युलर, वायुकोशीय, और माइक्रोवैस्कुलर परिपक्वता1,2। बाद के दो चरण मानव विकास में पूर्व और प्रसवोत्तर होते हैं जबकि पहले चार चरण विशेष रूप से भ्रूण के विकास के दौरान होते हैं जब तक कि अपरिपक्व जन्म नहीं होता है। भ्रूण चरण एंडोडर्मल रोगाणु परत में शुरू होता है और श्वासनली और फेफड़ों की कलियों के नवोदित के साथ समाप्त होता है। फेफड़े का विकास उपकला और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के बीच सिग्नलिंग के माध्यम से भाग में होता है4। इन इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप फेफड़ों की शाखाओं, प्रसार, सेलुलर भाग्य निर्धारण और विकासशील फेफड़ों के सेलुलर भेदभाव होते हैं। फेफड़े को संचालन क्षेत्रों (टर्मिनल ब्रोन्किओल्स के लिए श्वासनली) और श्वसन क्षेत्रों (एल्वियोली के लिए श्वसन ब्रोन्किओल्स) में विभाजित किया गया है। प्रत्येक क्षेत्र में अद्वितीय उपकला सेल प्रकार होते हैं; बेसल, स्रावी, ciliated, ब्रश, neuroendocrine, और ionocyte कोशिकाओं के संचालन वायुमार्ग 5 में शामिल हैं, श्वसन उपकला 6 में वायुकोशीय प्रकार I और II कोशिकाओं के बाद। विभिन्न सेल प्रकारों के विकास और चोट की प्रतिक्रिया के बारे में अभी भी बहुत कुछ अज्ञात है। आईपीएससी व्युत्पन्न फेफड़े organoid मॉडल तंत्र है कि मानव फेफड़ों के विकास ड्राइव के अध्ययन को सक्षम, फुफ्फुसीय समारोह पर आनुवंशिक उत्परिवर्तन के प्रभाव, और प्राथमिक मानव फेफड़ों के ऊतकों की आवश्यकता के बिना संक्रामक एजेंटों के लिए उपकला और मेसेनकाइम दोनों की प्रतिक्रिया.
भ्रूण भेदभाव के विभिन्न चरणों के अनुरूप मार्करों में CXCR4, cKit, FOXA2, और SOX17 निश्चित एंडोडर्म (DE) 7, FOXA2, TBX1, और SOX2 के लिए पूर्वकाल foregut endoderm (AFE) 8, और NKX2-1 के लिए प्रारंभिक फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के लिए शामिल हैं9। भ्रूण फेफड़ों के विकास में, अग्रभाग पृष्ठीय अन्नप्रणाली और वेंट्रल ट्रेकिआ में विभाजित होता है। दाएं और बाएं फेफड़ों की कलियां श्वासनली की कली 10 के चारों ओर दो स्वतंत्र आउटपाउचिंग के रूप में दिखाई देती हैं। ब्रांचिंग मॉर्फोजेनेसिस के दौरान, उपकला के आसपास मेसेनकाइम लोचदार ऊतक, चिकनी मांसपेशी, उपास्थि और वास्कुलचर 11 का उत्पादन करता है। उपकला और मेसेनकाइम के बीच बातचीत सामान्य फेफड़ों के विकास के लिए आवश्यक है। इसमें मेसेनकाइम द्वारा FGF1012 का स्राव और उपकला द्वारा उत्पादित SHH13 शामिल है।
यहां, हम तीन आयामी (3 डी) पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) में हिप्ससी के निर्देशित भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। जबकि इसी तरह के दृष्टिकोण हैं जो वायुकोशीय-जैसे 14,15 (डिस्टल) ऑर्गेनोइड्स या वायुमार्ग 16 (समीपस्थ) ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए एलपीसी चरण में छंटाई के माध्यम से फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के अलगाव को शामिल करते हैं, या वायुकोशीय-कोशिका और मेसेनकाइमल मार्करों और कली टिप पूर्वज ऑर्गेनोइड्स को व्यक्त करने के लिए मानव फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स बनाने के लिए वेंट्रल-पूर्वकाल फोरेगट गोलाकार उत्पन्न करते हैं। , इस विधि की ताकत दोनों फेफड़ों के उपकला और मेसेनकाइमल सेल प्रकारों को पैटर्न और ऑर्केस्ट्रेट करने के लिए शामिल है फेफड़ों की शाखाओं morphogenesis, परिपक्वता, और विट्रो में विस्तार orchestrate.
यह प्रोटोकॉल निश्चित एंडोडर्म, पूर्वकाल फोरगट एंडोडर्म और फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं के माध्यम से प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को निर्देशित करने के लिए छोटे अणुओं और विकास कारकों का उपयोग करता है। इन कोशिकाओं को तब शाखाओं और परिपक्वता सहित महत्वपूर्ण विकासात्मक चरणों के माध्यम से 3 डी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स में प्रेरित किया जाता है। विभेदन प्रोटोकॉल का सारांश चित्र 1a में दिखाया गया है जिसमें एंडोडर्मल और ऑर्गेनोइड भेदभाव की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां दिखाई गई हैं, जो चित्र 1 b में दिखाई गई हैं। चित्रा 1c, d एंडोडर्मल भेदभाव के जीन अभिव्यक्ति विवरण के साथ-साथ भेदभाव को पूरा करने के बाद फेफड़ों की उपकला कोशिकाओं की समीपस्थ और दूरस्थ आबादी दोनों की जीन अभिव्यक्ति को दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
3 डी पूरे फेफड़ों के ऑर्गेनोइड्स (डब्ल्यूएलओ) का सफल भेदभाव एक बहु-चरण, विस्तार पर ध्यान देने के साथ 6-सप्ताह के प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, जिसमें विकास कारकों और छोटे अणुओं के संपर्क में आने का समय, पासि…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन (सीआईआरएम) (DISC2-COVID19-12022) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Riferimenti
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