Artikkelen beskriver trinnvis rettet differensiering av induserte pluripotente stamceller til tredimensjonale hele lungeorganoider som inneholder både proksimale og distale epiteliale lungeceller sammen med mesenchyme.
Menneskelig lungeutvikling og sykdom har vært vanskelig å studere på grunn av mangel på biologisk relevante in vitro-modellsystemer . Menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) kan differensieres trinnvis i 3D multicellulære lungeorganoider, laget av både epitel- og mesenchymale cellepopulasjoner. Vi rekapitulerer embryonale utviklingssignaler ved å bevisst introdusere en rekke vekstfaktorer og små molekyler for effektivt å generere definitiv endoderm, fremre foregut endoderm, og deretter lunge forfedre celler. Disse cellene er deretter innebygd i vekstfaktor redusert (GFR) -kjeller membran matrise medium, slik at de spontant kan utvikle seg til 3D lunge organoider som svar på eksterne vekstfaktorer. Disse hele lungeorganoidene (WLO) gjennomgår tidlige lungeutviklingsstadier, inkludert forgrening av morfogenese og modning etter eksponering for deksametason, syklisk AMP og isobutylxanthine. WLOer har epitelceller i luftveiene som uttrykker markørene KRT5 (basal), SCGB3A2 (klubb) og MUC5AC (beger) samt alveolar epitelceller som uttrykker HOPX (alveolar type I) og SP-C (alveolar type II). Mesenchymale celler er også til stede, inkludert glatt muskel actin (SMA), og blodplate-avledet vekstfaktor reseptor A (PDGFRα). iPSC-avledede WLOer kan opprettholdes under 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflatemarkører for å rense en bestemt cellepopulasjon. iPSC-avledede WLOer kan også brukes til å studere menneskelig lungeutvikling, inkludert signalering mellom lungeepitelet og mesenchyme, for å modellere genetiske mutasjoner på menneskelig lungecellefunksjon og utvikling, og for å bestemme cytotoksisiteten til infektive midler.
Lungen er et komplisert, heterogent, dynamisk organ som utvikler seg i seks forskjellige stadier – embryonal, pseudoglandulær, canalicular, saccular, alveolar og mikrovaskulær modning1,2. De to siste fasene forekommer før og postnatalt i menneskelig utvikling, mens de fire første stadiene forekommer utelukkende under fosterutvikling med mindre preterm fødsel oppstår3. Den embryonale fasen begynner i det endodermale bakterielaget og avsluttes med spirende luftrør og lungeknopper. Lungeutvikling skjer delvis via signalering mellom epitelceller og mesenchymale celler4. Disse interaksjonene resulterer i lungeforgrening, spredning, cellulær skjebnebestemmelse og cellulær differensiering av den utviklende lungen. Lungen er delt inn i ledende soner (luftrør til terminalbronkiolene) og åndedrettssoner (respiratoriske bronkioler til alveolene). Hver sone inneholder unike epitelcelletyper. inkludert basale, sekretoriske, cilierte, børste-, nevroendokrine og ionocyttceller i den ledende luftveiene5, etterfulgt av alveolar type I- og II-celler i respiratorisk epitel6. Mye er fortsatt ukjent om utvikling og respons på skade på de ulike celletypene. iPSC-avledede lungeorganoidmodeller muliggjør studiet av mekanismer som driver menneskelig lungeutvikling, effekten av genetiske mutasjoner på lungefunksjon, og responsen fra både epitelet og mesenchymet til smittsomme stoffer uten behov for primært humant lungevev.
Markører som tilsvarer de ulike stadiene av embryonal differensiering inkluderer CXCR4, cKit, FOXA2 og SOX17 for definitiv endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 og SOX2 for fremre foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lungegenitorceller9. I embryonal lungeutvikling deler foregut seg i dorsal spiserøret og ventral luftrøret. Knoppene til høyre og venstre lunger vises som to uavhengige outpouchings rundt trakeal knopp10. Under forgrening av morfogenese produserer mesenchymet rundt epitelet elastisk vev, glatt muskel, brusk og vaskulatur11. Samspillet mellom epitel og mesenchyme er avgjørende for normal lungeutvikling. Dette inkluderer sekresjonen av FGF1012 av mesenchyme og SHH13 produsert av epitelet.
Her beskriver vi en protokoll for rettet differensiering av hiPSCer til tredimensjonale (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens det er lignende tilnærminger som inkorporerer isolasjon av lungeforfedrederceller via sortering på LPC-scenen for å lage alveolarlignende 14,15 (distale) organoider eller luftveier16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-fremre foregut sfæroider for å lage menneskelige lungeorganoider som uttrykker alveolarcelle og mesenchymale markører og knoppeprogenitorer , styrken av denne metoden er inkludering av både lunge epitelial og mesenchymal celletyper for å mønstre og orkestrere lungeforgrening morfogenese, modning og ekspansjon in vitro.
Denne protokollen bruker små molekyler og vekstfaktorer for å lede differensiering av pluripotente stamceller gjennom definitiv endoderm, fremre foregut endoderm og lungeforfedrederceller. Disse cellene blir deretter indusert i 3D hele lungeorganoider gjennom viktige utviklingstrinn, inkludert forgrening og modning. Oppsummeringen av differensieringsprotokollen er vist i figur 1a med representative brightfield-bilder av endodermal og organoid differensiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genuttrykksdetaljene til endodermal differensiering samt genuttrykket til både proksimale og distale populasjoner av lungeepitelceller etter å ha fullført differensiering.
Den vellykkede differensiering av 3D hele lungeorganoider (WLO) er avhengig av en flertrinns, 6-ukers protokoll med oppmerksomhet på detaljer, inkludert tidspunkt for eksponering for vekstfaktorer og små molekyler, cellulær tetthet etter passivitet og kvaliteten på hiPSCer. Hvis du vil ha feilsøking, kan du se tabell 2. hiPSCer bør være omtrent 70% -80% sammenfallende, med mindre enn 5% spontan differensiering før dissosiasjon. Denne protokollen krever “mTeSR plus”-medium. Imidlertid har vanlig “…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Cell Culture | |||
12 well plates | Corning | 3512 | |
12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
Dispase | StemCellTech | 7913 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
FBS | Gibco | 10082139 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
Matrigel | Corning | 354230 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
Growth Factors/Small Molecules | |||
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | |
FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
Primary antibodies | Dilution rate | ||
CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |