Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar
Summary
O artigo descreve a diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes induzidas a organoides pulmonares inteiros tridimensionais contendo células pulmonares epiteliais proximais e disais, juntamente com mesenchyme.
Abstract
O desenvolvimento pulmonar humano e a doença têm sido difíceis de estudar devido à falta de sistemas de modelos in vitro biologicamente relevantes. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) podem ser diferenciadas em organoides pulmonares multicelulares 3D, feitos de populações epiteliais e células mesenquimais. Recapitulamos pistas de desenvolvimento embrionário introduzindo temporalmente uma variedade de fatores de crescimento e pequenas moléculas para gerar eficientemente o endoderme definitivo, o endoderme anterior e, posteriormente, as células progenitoras pulmonares. Essas células são então incorporadas no meio de matriz de membrana de fator de crescimento (GFR)-porão, permitindo que elas se desenvolvam espontaneamente em organoides pulmonares 3D em resposta a fatores de crescimento externos. Estes organoides pulmonares inteiros (WLO) passam por estágios iniciais de desenvolvimento pulmonar, incluindo morfogênese ramificada e maturação após exposição à dexametasona, AMP cíclico e isobutylxanthine. Os WLOs possuem células epiteliais das vias aéreas expressando os marcadores KRT5 (basal), SCGB3A2 (clube) e MUC5AC (cálice), bem como células epiteliais alveolares expressando HOPX (tipo alveolar I) e SP-C (alveolar tipo II). Células mesenquimais também estão presentes, incluindo actina muscular lisa (SMA), e receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas A (PDGFRα). Os WLOs derivados do iPSC podem ser mantidos em condições de cultura 3D por muitos meses e podem ser classificados para marcadores de superfície para purificar uma população celular específica. Os WLOs derivados do iPSC também podem ser utilizados para estudar o desenvolvimento pulmonar humano, incluindo a sinalização entre o epitélio pulmonar e o mesenquimme, para modelar mutações genéticas na função e desenvolvimento das células pulmonares humanas, e para determinar a citotoxicidade dos agentes infecciosos.
Introduction
O pulmão é um órgão complicado, heterogêneo e dinâmico que se desenvolve em seis estágios distintos – embrionário, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar e maturação microvascular1,2. As duas últimas fases ocorrem pré e pós-natal no desenvolvimento humano, enquanto os quatro primeiros estágios ocorrem exclusivamente durante o desenvolvimento fetal, a menos que ocorram nascimentos prematuros3. A fase embrionária começa na camada de germes endodérmicos e termina com o brotamento da traqueia e dos botões pulmonares. O desenvolvimento pulmonar ocorre em parte através da sinalização entre as células epiteliais e mesenquimais4. Essas interações resultam em ramificação pulmonar, proliferação, determinação do destino celular e diferenciação celular do pulmão em desenvolvimento. O pulmão é dividido em zonas de condução (traqueia para os brônquios terminais) e zonas respiratórias (brônquios respiratórios aos alvéolos). Cada região contém tipos únicos de células epiteliais; incluindo células basais, secretas, ciliadas, escovas, neuroendócrinas e ionócitos nas vias aéreas condutoras5, seguidas por células alveolares tipo I e II no epitélio respiratório6. Ainda não se sabe muito sobre o desenvolvimento e a resposta à lesão dos vários tipos de células. Modelos organoides fundidas derivadas do iPSC permitem o estudo de mecanismos que impulsionam o desenvolvimento pulmonar humano, os efeitos das mutações genéticas na função pulmonar e a resposta tanto do epitélio quanto do mesenquime a agentes infecciosos sem a necessidade de tecido pulmonar humano primário.
Os marcadores correspondentes aos vários estágios de diferenciação embrionária incluem CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 para endoderme definitivo (DE)7, FOXA2, TBX1 e SOX2 para endoderme anterior (AFE)8, e NKX2-1 para células progenitoras pulmonares precoces9. No desenvolvimento pulmonar embrionário, o foregut se divide no esôfago dorsal e na traqueia ventral. Os botões dos pulmões direito e esquerdo aparecem como dois outpouchings independentes ao redor do broto traqueal10. Durante a morfogênese ramificada, o mesenquima em torno do epitélio produz tecido elástico, músculo liso, cartilagem e vasculatura11. A interação entre o epitélio e o mesenquime é essencial para o desenvolvimento pulmonar normal. Isso inclui a secreção de FGF1012 pelo mesenchyme e SHH13 produzidos pelo epitélio.
Aqui, descrevemos um protocolo para a diferenciação direcionada de hiPSCs em organoides pulmonares tridimensionais (3D) inteiros (WLO). Embora existam abordagens semelhantes que incorporem o isolamento de células progenitoras pulmonares através da triagem no estágio LPC para fazer organoides allveolares 14,15 (distal) ou organoides das vias aéreas16 (proximal), ou gerar esferoides ventral-anteriores para fazer organoides pulmonares humanos expressando marcadores alveolares e mesenquimais e organoides progenitores de bud , a força deste método é a inclusão de ambos os tipos de células epiteliais pulmonares e mesenquimais para padronizar e orquestrar morfogênese de ramificação pulmonar, maturação e expansão in vitro.
Este protocolo utiliza pequenas moléculas e fatores de crescimento para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes através de endoderme definitivo, endoderme anterior de foregut e células progenitoras pulmonares. Essas células são então induzidas em organoides pulmonares 3D inteiros através de importantes etapas de desenvolvimento, incluindo ramificação e maturação. O resumo do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1a com imagens representativas de brightfield de diferenciação endodérmica e organoide mostrada na Figura 1b. A Figura 1c,d mostra os detalhes da expressão genética da diferenciação endodérmica, bem como a expressão genética das populações proximais e distais das células epiteliais pulmonares após completar a diferenciação.
Protocol
Representative Results
Discussion
A diferenciação bem sucedida de organoides pulmonares inteiros 3D (WLO) conta com um protocolo de várias etapas e seis semanas com atenção aos detalhes, incluindo tempo de exposição a fatores de crescimento e pequenas moléculas, densidade celular após a passagem e a qualidade dos hiPSCs. Para solucionar problemas, consulte tabela 2. hiPSCs devem ser aproximadamente 70%-80% confluentes, com menos de 5% de diferenciação espontânea antes da dissociação. Este protocolo exige o meio “mTeSR plus”…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
Riferimenti
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