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Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

DOI:

10.3791/62456

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Diego School of Medicine, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine, 3Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

In This Article

Summary

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L'articolo descrive la differenziazione diretta graduale delle cellule staminali pluripotenti indotte in organoidi polmonari interi tridimensionali contenenti cellule polmonari epiteliali sia prossimali che distali insieme a mesenchima.

Abstract

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Lo sviluppo e la malattia polmonare umana sono stati difficili da studiare a causa della mancanza di sistemi modello in vitro biologicamente rilevanti. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) possono essere differenziate gradualmente in organoidi polmonari multicellulari 3D, costituiti da popolazioni di cellule epiteliali e mesenchimali. Ricapitoliamo i segnali di sviluppo embrionale introducendo temporalmente una varietà di fattori di crescita e piccole molecole per generare in modo efficiente l'endoderma definitivo, l'endoderma dell'intestino anteriore e successivamente le cellule progenitrici polmonari. Queste cellule vengono quindi incorporate nel mezzo della matrice della membrana basale a fattore di crescita ridotto (GFR), consentendo loro di svilupparsi spontaneamente in organoidi polmonari 3D in risposta a fattori di crescita esterni. Questi organoidi polmonari interi (WLO) subiscono fasi iniziali di sviluppo polmonare tra cui morfogenesi ramificata e maturazione dopo l'esposizione a desametasone, AMP ciclico e isobutilxantina. I WLO possiedono cellule epiteliali delle vie aeree che esprimono i marcatori KRT5 (basale), SCGB3A2 (club) e MUC5AC (calice) e cellule epiteliali alveolari che esprimono HOPX (tipo alveolare I) e SP-C (tipo alveolare II). Sono presenti anche cellule mesenchimali, tra cui l'actina della muscolatura liscia (SMA) e il recettore A del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα). I WLO derivati da iPSC possono essere mantenuti in condizioni di coltura 3D per molti mesi e possono essere ordinati per i marcatori di superficie per purificare una specifica popolazione cellulare. I LLO derivati da iPSC possono anche essere utilizzati per studiare lo sviluppo polmonare umano, compresa la segnalazione tra l'epitelio polmonare e il mesenchima, per modellare mutazioni genetiche sulla funzione e lo sviluppo delle cellule polmonari umane e per determinare la citotossicità degli agenti infettivi.

Introduction

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Il polmone è un organo complicato, eterogeneo e dinamico che si sviluppa in sei fasi distinte: maturazione embrionale, pseudoghiandolare, canalicolare, sacculare, alveolare e microvascolare1,2. Le ultime due fasi si verificano prima e dopo la nascita nello sviluppo umano, mentre le prime quattro fasi si verificano esclusivamente durante lo sviluppo fetale, a meno che non si verifichi la nascita pretermine3. La fase embrionale inizia nello strato germinale endodermico e si conclude con il germogliamento della trachea e delle gemme polmonari. Lo sviluppo polmonare avviene in parte attrave....

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Protocol

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Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180).

1. Induzione definitiva dell'endoderma da cellule staminali pluripotenti indotte (Giorno 1 - 3)

  1. Scongelare lentamente il fattore di crescita ridotto (GFR) -membrana basale (BM) mezzo di matrice su ghiaccio 30 minuti prima dell'uso. In miscela DMEM/F12 a freddo, diluire il mezzo della matrice GFR BM 1:1 in modo tale che costituisca il 50% di questo mezzo. Posizionare le punte della pipetta P1000 nel congelatore per raffreddare prima dell'uso.
  2. Rivestire ogni pozzetto di una piast....

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Results

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24 ore dopo la placcatura, giorno 1, le iPSC dovrebbero essere confluenti al 50% -90%. Il giorno 2, DE dovrebbe essere confluente al 90% -95%. Durante l'induzione de, è comune osservare una significativa morte cellulare il giorno 4, ma le cellule attaccate manterranno una morfologia compatta di ciottoli (Figura 2b). Interrompere la differenziazione se la maggior parte delle cellule aderenti si stacca e considera di abbreviare l'esposizione ai mezzi DE con activina A di 6-12 ore. Durante l'in.......

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Discussion

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Il successo della differenziazione degli organoidi polmonari interi 3D (WLO) si basa su un protocollo multi-step di 6 settimane con attenzione ai dettagli, incluso il tempo di esposizione a fattori di crescita e piccole molecole, la densità cellulare dopo il passaggio e la qualità delle hiPSC. Per la risoluzione dei problemi, vedere la Tabella 2. Le hiPSC dovrebbero essere confluenti per circa il 70%-80%, con meno del 5% di differenziazione spontanea prima della dissociazione. Questo protocollo richiede .......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questa ricerca è stata supportata dal California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
12 pozzettipiastre Corning3512
inserti a 12 pozzetti, 0,4um, traslucidoVWR10769-208
2-mercaptoetanoloSigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
acido ascorbicoSigmaA4544
B27 senza acido retinoicoThermoFisher12587010
Albumina sierica bovina (BSA) Frazione V, soluzione al 7,5%Gibco15260-037
DispaseStemCellTech7913
DMEM/F12Gibco10565042
FBSGibco10082139
GlutamaxLife Tecnologie35050061
Ham' s F12Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
Iscove' s Dulbecco' modificato s Medium (IMDM) + GlutamaxInvitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
MonotiogliceroloSigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/cassa)Stem Cell Tech5825
N2ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + GlutamaxLife Technologies12633012
TrypLEGibco12605-028
Y-27632 (Inibitore della roccia)R& D Systems1254/1
Fattori di crescita/Piccole molecole
Activina AR& D Systems338-AC
Acido retinoico all-trans (RA)Sigma-AldrichR2625
BMP4R& D Systems314-BP/CF
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CHIR99021Abcamab120890
DesametasoneSigma-AldrichD4902
DorsomorfinaR& D Systems3093
EGFR& D Systems236-EG
FGF10R& D Systems345-FG/CF
FGF7R& D Systems251-KG/CF
IBMX (3-isobtil-1-metilxantina)Sigma-AldrichI5879
SB431542R& D Systems1614
VEGF/PIGFR& D Systems297-VP/CF
strong>Anticorpi primariTasso di diluizione
CXCR4-PER& D SystemsFAB170P1:200 (F)
HOPXSanta Cruz Biotechsc-3987030.180555556
HTII-280Terrace BiotechTB-27AHT2-2800.145833333
KRT5Abcamab526350.180555556
NKX2-1Abcamab760130.25
NKX2-1-APCLS-BIOLS-C2644371:1000 (F)
proSPCAbcamab408710.215277778
SCGB3A2Abcamab1818530.25
SOX2InvitrogenMA1-0140.180555556
SOX9R& D SystemsAF30750.180555556
SPB (maturo)7 Hills486041: 1500 (F) 1:500 (W)a
SPC (maturo)LS BioLS-B91611:100 (F); 1:500 (W) a
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
  2. Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
  3. Leibel, S., Post, M.

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Lung OrganoidsInduced Pluripotent Stem Cells3D Cell CultureLung DevelopmentDisease ModelingDefinitive EndodermBranching MorphogenesisLung Progenitor CellsEpithelial Mesenchymal InteractionImmunocytochemistry

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