Artiklen beskriver trin klog rettet differentiering af inducerede pluripotente stamceller til tre-dimensionelle hele lungeorganoider, der indeholder både proksimale og distale epitel lungeceller sammen med mesenchyme.
Menneskets lungeudvikling og sygdom har været vanskelig at studere på grund af manglen på biologisk relevante in vitro-modelsystemer . Human induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) kan differentieres trinvist i 3D multicellulære lungeorganoider, lavet af både epitel og mesenkymale cellepopulationer. Vi generobrer embryonale udviklingssignaler ved tidsmæssigt at introducere en række vækstfaktorer og små molekyler til effektivt at generere endelige endoderm, forreste foregut endoderm og efterfølgende lunge stamfaderceller. Disse celler er derefter indlejret i vækstfaktor reduceret (GFR)-kælder membran matrix medium, så de spontant kan udvikle sig til 3D lungeorganoider som reaktion på eksterne vækstfaktorer. Hele disse lungeorganoider (WLO) gennemgår tidlige lungeudviklingsfaser, herunder forgrening af morfogenese og modning efter eksponering for dexamethason, cyklisk AMP og isobutylxanthine. WLOs besidder luftvejs epitelceller, der udtrykker markørerNE KRT5 (basal), SCGB3A2 (club) og MUC5AC (pokal) samt alveolær epitelceller, der udtrykker HOPX (alveolær type I) og SP-C (alveolær type II). Mesenkymale celler er også til stede, herunder glat muskel actin (SMA), og blodplade-afledt vækstfaktor receptor A (PDGFRα). iPSC afledte WLOs kan opretholdes i 3D-kulturforhold i mange måneder og kan sorteres for overflademarkører for at rense en bestemt cellepopulation. iPSC afledte WLOs kan også udnyttes til at studere menneskets lunge udvikling, herunder signalering mellem lunge epitel og mesenchyme, at modellere genetiske mutationer på human lungecellefunktion og udvikling, og at bestemme cytotoksiciteten af infektiøs midler.
Lungen er et kompliceret, heterogent, dynamisk organ, der udvikler sig i seks forskellige stadier – embryonale, pseudoglandære, kanalkulære, sakkalære, alveolær, og mikrovaskulær modning1,2. De to sidstnævnte faser forekommer før og postnatalt i menneskets udvikling, mens de første fire faser udelukkende forekommer under fostrets udvikling, medmindre der forekommer for tidlig fødsel3. Den embryonale fase begynder i endodermalt kimlag og afsluttes med den spirende luftrør og lungeknopper. Lungeudvikling sker til dels via signalering mellem epitel og mesenkymale celler4. Disse interaktioner resulterer i lunge forgrening, spredning, cellulær skæbne bestemmelse og cellulære differentiering af den udviklende lunge. Lungen er opdelt i ledende zoner (luftrør til terminalen bronkier) og luftvejeszoner (respiratoriske bronkier til alveoler). Hver zone indeholder entydige epitelcelletyper. herunder basal, sekretorisk, cilieret, børste, neuroendokrine og ionocytceller i de ledende luftveje5, efterfulgt af alveolær type I og II-celler i respiratorisk epitel6. Meget er stadig ukendt om udviklingen og reaktionen på skade af de forskellige celletyper. iPSC afledte lungeorganoid modeller muliggøre undersøgelse af mekanismer, der driver menneskelige lunge udvikling, virkningerne af genetiske mutationer på lungefunktion, og reaktionen af både epitel og mesenchyme til infektiøse stoffer uden behov for primære menneskelige lungevæv.
Markører svarende til de forskellige stadier af embryonal differentiering omfatter CXCR4, cKit, FOXA2, og SOX17 for endelige endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1, og SOX2 for forreste foregut endoderm (AFE)8, og NKX2-1 for tidlige lunge stamfader celler9. I embryonale lunge udvikling, foregut opdeler i dorsale spiserøret og ventral luftrør. Knopperne i højre og venstre lunger fremstår som to uafhængige outpouchings omkring tracheal bud10. Under forgrening morfogenese, mesenchyme omkring epitel producerer elastisk væv, glat muskel, brusk, og vaskulatur11. Samspillet mellem epitel og mesenchyme er afgørende for normal lungeudvikling. Dette omfatter udskillelsen af FGF1012 af mesenchyme og SHH13 produceret af epitelet.
Her beskriver vi en protokol for den målrettede differentiering af hiPSCs i tredimensionelle (3D) hele lungeorganoider (WLO). Mens der er lignende tilgange, der omfatter isolering af lunge stamfader celler via sortering på LPC fase for at gøre alveolær-lignende14,15 (distal) organoider eller luftveje16 (proksimale) organoider, eller generere ventral-anterior foregut spheroids at gøre menneskelige lunge organoider udtrykke alveolær-celle og mesenkymal markører og bud tip stamfader organoider17 , styrken af denne metode er inddragelsen af både lunge epitel og mesenkymal celletyper til mønster og orkestrere lunge forgrening morfogenese, modning, og ekspansion in vitro.
Denne protokol bruger små molekyler og vækstfaktorer til at lede differentiering af pluripotente stamceller gennem endelige endoderm, forreste foregut endoderm, og lunge stamfader celler. Disse celler er derefter induceret i 3D hele lungeorganoider gennem vigtige udviklingsmæssige trin, herunder forgrening og modning. Sammenfatningen af differentieringsprotokollen er vist i figur 1a med repræsentative lysbilleder af endodermal og organoiddifferentiering vist i figur 1b. Figur 1c,d viser genekspression detaljer om endodermal differentiering samt genekspression af både de proksimale og distale populationer af lungeepilele celler efter at have afsluttet differentiering.
Den vellykkede differentiering af 3D hele lungeorganoider (WLO) er afhængig af en flertrins, 6-ugers protokol med sans for detaljer, herunder tidspunktet for eksponering for vækstfaktorer og små molekyler, cellulær tæthed efter passaging og kvaliteten af hiPSCs. Du kan finde fejlfinding i tabel 2. hiPSC’er bør være ca. 70%-80% sammenflydende, med mindre end 5% spontan differentiering før dissociation. Denne protokol kræver “mTeSR plus” medium; men almindeligt “mTeSR” medium er også blevet brugt…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Cell Culture | |||
12 well plates | Corning | 3512 | |
12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
Dispase | StemCellTech | 7913 | |
DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
FBS | Gibco | 10082139 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
Matrigel | Corning | 354230 | |
Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
Growth Factors/Small Molecules | |||
Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
EGF | R&D Systems | 236-EG | |
FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
Primary antibodies | Dilution rate | ||
CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |