肠上皮不仅提供营养吸收,而且保护免受有毒物质的侵害。顶端最顶端的上皮细胞间连接,即紧密连接,调节细胞旁溶质和离子通透性。这里描述了使用Ussing室技术制备粘膜片和评估紧密连接的离子选择性的方案。
Ussing室技术最初由丹麦科学家Hans Ussing于1951年发明,用于研究钠在青蛙皮肤上的跨细胞运输。从那时起,这种技术已被应用于许多不同的组织,以研究跨膜运输的生理参数。Ussing室方法比其他方法更可取,因为可以使用天然组织,使其更适用于 体内发生的事情。然而,由于使用天然组织,通量低,时间有限,组织制备需要技能和培训。这些腔室已被用于研究各种组织中的特定转运蛋白,了解疾病病理生理学,例如囊性纤维化,研究药物转运和摄取,特别是有助于了解肠道中的营养转运。鉴于组织的整个上皮运输过程,不仅经上皮途径,而且细胞旁途径也很重要。紧密连接是组织特异性细胞旁细胞通透性的关键决定因素。在本文中,Ussing室技术将用于通过测量经上皮电导和稀释电位来评估离子的细胞旁持久性。
Ussing室方法最初由丹麦科学家Hans Ussing开发。Ussing首先用它来测量钠在青蛙皮肤上的传输短路电流,之后观察到NaCl可以以陡峭的浓度梯度穿过皮肤1。他的系统由安装在两个腔室之间的青蛙皮组成,可以进入皮肤的两侧。每个腔室都包含Ringer的溶液,该溶液被循环和充气。两个狭窄的琼脂振铃桥位于皮肤附近,连接到饱和的KCl-甘汞电极,测量了由增强剂读取的电位差。第二对琼脂铃声桥位于每个腔室的另一端,连接到烧杯,其饱和KCl饱和AgCl以施加电池提供的电动势。使用电位分压器来调节电压,使皮肤上的电位差保持为零,从而产生短路条件。还连接了一个微安表来读取通过皮肤的电流(参见参考文献1 中的原始腔室设计)。
在过去的70年中,该技术已被应用于许多不同的组织,特别是肠道组织,以研究营养和离子运输。例如,通过在这些腔室中安装兔子回肠来研究霍乱引起的腹泻的机制,发现霍乱毒素引起的腹泻是由cAMP2介导的。此外,这些腔室还用于研究通过Na +-葡萄糖共转运蛋白1(SGLT1)3的潜在葡萄糖转运机制。我们的实验室专注于肠上皮细胞中的跨细胞和旁细胞转运。使用Ussing室方法,在Claudin 15敲除小鼠中评估肽转运,这些小鼠具有受损的旁细胞钠转运,使用Ussing室测量不可水解的二肽甘氨酰肌氨酸的吸收。研究发现,腔内Na+ 稳态对质子偶联肽转运很重要4。此外,这些腔室还用于研究小鼠盲肠中的阴离子分泌,以响应丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶5激活的蛋白酶激活受体1的粘膜下激活。
Ussing腔室最近也被用于评估上皮组织中的细胞旁通路。细胞旁通路由紧密连接调节,紧密连接是在两个或多个细胞相遇时形成的蛋白质复合物6。屏障功能和离子选择性(阴离子或阳离子是否能够选择性地通过紧密连接)由克劳丁家族蛋白的存在决定;其中一些充当屏障(克劳丁3和7),阴离子孔(克劳丁10a)或阳离子孔(克劳丁2,10b和15)7。已经使用其他方法评估细胞旁通路,例如伴有血浆FITC浓度8或EDTA-Cr9的FITC口服强饲;然而,这些技术的分辨率较低,不能评估离子选择性或肠道部分的特定部分。然而,使用腔室可用于评估目标离子的稀释电位,从而确定紧密连接的离子选择性。例如,使用NaCl,可以通过稀释膜的一侧(通常是粘膜侧)并测量经上皮电位差的变化来计算Na +和Cl–紧密连接的选择性。Na+和Cl–的相对渗透率可以通过Goldman-Hodgkin-Katz方程10来估计,而紧密结的选择性可以使用Kimizuka-Koketsu方程11来估计。因此,这些腔室具有测量组织的电生理参数的优点,因此比其他低分辨率方法提供了有关离子通过紧密连接的更多信息。
Ussing室方法不仅限于肠道,尽管它被广泛用于有关肠道的研究中,但它也有许多其他应用。例如,这些腔室已被用于研究囊性纤维化,特别是氯化物通道囊性纤维化跨膜电导调节剂(CFTR)12。囊性纤维化是由CFTR13突变引起的,导致呼吸道上皮细胞的氯离子分泌和液体运输受损,并导致更厚,更干燥的粘膜层14。气道上皮CFTR的研究已经用这些腔室进行,不仅了解疾病,而且发现治疗疾病的方法。例如,在具有导致囊性纤维化的罕见突变的患者中,对患者呼吸上皮细胞的分析已被用于测试Orkambi和放大器共同治疗等疗法15。
Ussing室也用于研究药物递送途径,例如用人体活检组织来研究药物摄取和药代动力学16。肠道摄取不是药物输送的唯一途径。这些腔室也用于研究鼻腔药物输送系统17。还对眼睛进行了Ussing室的药物输送研究。在兔子角膜中,使用Labrasol进行渗透性和摄取研究,Labrasol是一种旨在增加药物在组织中吸收的药物18。另一项研究检查了苄基氯化铵对兔巩膜中经巩膜药物递送的影响19。
Ussing腔室方法是有用的,因为可以使用天然组织。因此,它优于 体外 模型,如Caco-2细胞系。然而,该技术需要技能和时间来制备样品,因此不适用于高通量应用。细胞单层的电生理特性可以使用这些腔室中的细胞培养插入物进行研究。最近的发现允许培养类器官,这些类器官是从上皮或内皮干细胞的收获中培养的微型器官20。类器官培养可以纵以在单层中生长,从而可以将类器官安装在 Ussing 室 中 21 。可以研究各种上皮和内皮组织的类器官,降低所需的动物数量,因为类器官培养可以长期维持。这也将提高通量,因为不需要耗时且费力的组织解剖和制备步骤。未来,Ussing腔室研究将继续对研究组织运输非常有用,并且在个性化医疗领域尤为重要。
以下方案演示了Ussing室方法的应用,通过测量NaCl的稀释电位来评估Claudin 15敲除(Cldn15-/-)小鼠和野生型(WT)对照的小肠中紧密连接的permselectivity和屏障功能。紧密连接(TJ)在两个或多个细胞在上皮和内皮组织中相遇的点上形成。双细胞紧密连接(bTJ),特别是在bTJ中发现的克劳丁家族蛋白,被认为决定了TJ7的屏障功能和持久性。Cldn15-/-小鼠具有巨大的小肠22,并且由于通过claudin 154,23,24发生的肠道Na +回收的损失而降低了营养吸收能力。Cldn15-/- 小鼠的Na +稳态受损,这使它们成为研究TJ的持久性的有趣模型。以下方案通过测量中小肠中NaCl(PNa / PCl)的稀释电位来评估TJ对NaCl的渗透性。简而言之,通过稀释膜的一侧(M侧或S侧,两者在下面的方案中测量)而发生的膜电位差的变化可用于计算Na +(PNa)和Cl–(PCl)的渗透率,并且稀释电位(PNa / PCl)将显示紧密连接是否具有阳离子或阴离子选择性。
该协议中的实验是使用定制的Ussing室(图1A)进行的,该室由两半组成,其间垂直安装肠道制剂,电压钳放大器,电记录器,电极,盐桥,林格氏溶液,HEPES缓冲液(150mM NaCl),稀释的HEPES缓冲液(75mM NaCl),肠道制剂(有关设备的详细信息,请参见 材料表)。
在该实验中,使用Ussing室测量Cldn15-/-和WT小鼠小肠中NaCl的基线电参数和稀释电位。在进行Ussing腔室实验时,验证实验中使用的膜制备是否可行非常重要。这通常通过添加葡萄糖或腺苷酸环化酶激活剂毛喉素并观察ICC是否适当升高(小鼠100-300μA / cm 2)来完成。评估肠道制剂是否可以接受使用的另一种方法是观察组织的电导率。受损组织通常具有高于正常水平?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作由17K00860(到HH)和19K20152(到NI)支持。WH要感谢大冢俊美奖学金基金会在2018-2021年期间提供的财务支持。
#3 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm | |
#7 polyethyl tubing | Hibiki | outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm | |
10 mL locking syringe | Terumo | SS-10LZ | Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling |
19 g needle | Terumo | NN-1938R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
23 g needle | Terumo | NN-2332R | Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container |
5 mm punch | NA | NA | Use to punch holes in filter paper and parafilm |
acupuncture needles | Seirin | NS | Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate |
Agar | Fujifilm Wako | 010-15815 | |
Alligator clips | NA | NA | Connects the electrode to the amplifier |
CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
D(-)-Mannitol | Fujifilm Wako | 133-00845 | This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer |
D(+)-Glucose | Fujifilm Wako | 049-31165 | |
Dissection kit | You will need, scissors and curved forceps | ||
Dissection plates | We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber | ||
DMSO | Sigma | 472301-500ML | For making forskolin stock |
Electrical recorder | TOA Electronics | PRR-5041 | Other equivalent electrical recorders are available commercially |
Epithelial voltage clamp amplifier | Nihon Kohden | CEZ9100 | Other equivalent amplifiers are available commerically |
filter paper, cut into squares | NA | NA | Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation |
fine forceps | Fast Gene | FG-B50476 | For blunt dissection of the muscle layer |
Forskolin | Alomone Labs | F-500 | Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM |
HEPES | Sigma | H4034-1KG | |
Indomethacin | Sigma | I7338-5G | Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM |
K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
KCl/calomel electrode | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
KH2PO4 | Kanto chemical | 32379-00 | |
L(+)-Glutamine | Fujifilm Wako | 074-00522 | |
MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
Mixed Gas (95% O2/5% CO2) | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution | |
NaCl | Fujifilm Wako | 191-01665 | |
NaCl electrode | NA | NA | Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire |
NaHCO3 | Fujifilm Wako | 191-01305 | |
O2 Gas | Shizuoka Oxygen Company | Used for bubbling chambers when using HEPES buffer | |
parafilm | Bemis | PM-996 | Used to help seal Ussing chambers |
pH meter | DKK-TOA Corp | HM-305 | HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C |
pH meter electrode | DKK-TOA Corp | GST-5311C | |
silicone rubber | Shinetsu Chemical | KE-12 | Used to fill dissection plates |
silver wire | Used for making NaCl electrodes | ||
Small jars w/ plastic lids | NA | NA | Use for NaCl electrodes |
stereomicroscope | Zeiss | Stemi 305 | A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily |
Tris (Trizma base) | Sigma | T1503-1KG | Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers |
Ussing chambers | Sanki Kagaku Kougei | These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm | |
Water pump and heating system | Tokyo Rikakikai Co. Ltd. | NTT-110 |