우리는 치과 플라크를 필터링하고 숙주 박테리아와 공동 배양하여 새로운 세균 성 물리, 사카리박테리아의 성장하기 어려운 구성원을 격리하는 방법을 보여줍니다.
많은 세균성 종은 표준 방법을 사용하여 실험실에서 배양 될 수 없으며, 지구상에서 미생물 다양성의 대부분을 연구하는 데 상당한 장벽을 포즈. 새로운 접근은 연구원이 효과적으로 실험실에서 유효한 강력한 공구를 사용하여 그들의 생리학 및 생활양식을 공부할 수 있도록 이 비배양되지 않는 박테리아를 배양하는 데 필요합니다. 후보 필라 방사선 (CPR)은 지구상의 살아있는 다양성의 ~ 15 %를 포함하는 경작되지 않은 박테리아의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 이 그룹의 첫 번째 분리는 사카리박테리아 필럼의 구성원이었다,‘나노 신박터 lyticus’균주 TM7x. TM7x는 세균 호스트, Schaalia odontolytica, 균주 XH001과 직접 접촉공생으로 사는 비정상적으로 작은 박테리아이다. 비정상적으로 작은 세포 크기와 공생 유기체로서의 라이프 스타일을 활용하여 치과 플라크에서 사카리박테리아를 빠르게 배양하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 0.2 μm 필터를 통해 치장 플라크의 현탁액을 필터링한 다음 수집된 사카리박테리아 세포를 농축하고 숙주 생물의 배양을 감염하는 방법을 보여줍니다. 결과 공동 배양은 어떤 정상적인 세균 배양및 감염이 PCR에 의해 확인되기 때문에 통과될 수 있다. 결과 이진 배양은 실험실에서 유지 관리되고 향후 실험에 사용될 수 있습니다. 오염이 가능하지만, 이진 배양은 호스트의 추가 여과 및 재감염또는 감염된 식민지에 대한 이진 배양 및 스크리닝을 도금하여 정제될 수 있다. 우리는 이 프로토콜이 다른 샘플 유형 및 환경으로 확장되어 심폐 소생술에서 더 많은 종의 재배로 이어질 수 있기를 바랍니다.
박테리아의 새로운 종을 배양하고 실험실로 데려 오는 것은 그들의 생리학 및 그들의 미생물 지역 사회 내의 더 넓은 상호 작용을 더 잘 이해하기 위하여 강력한 실험을 허용합니다. 이러한 질문(예: “메타 오믹스”)을 심문하는 문화가 없는 방법이 있지만, 다양한 미생물 집단의 복잡한 상호 작용으로 인해 단일 변수를 따로 떼어내고 의미 있는 결론에 도달하기가 어렵습니다. 박테리아를 배양하는 것은 많은 이점이 있는 동안, 박테리아를 고립시키고 순수한 문화에서 그것을 성장하는 많은 잠재적인 장벽이 있습니다. 잠재적인 특정 성장 요구 사항은 pH, 산소 장력, 비타민, 성장 인자, 신호 분자 또는 성장을 유도하기 위해 직접 세포 접촉을 포함한다1. 그러나, 특정 auxo트로피는 박테리아의 새로운 종을 배양하는 1 차적인 억지력이라고 믿어집니다. 표준 미디어 제형은 특정 비타민 이나 탄소 소스와 같은 재배되지 않은 박테리아에 필요한 많은 영양소가 부족합니다. 이 누락된 분자는 배양되지 않은 박테리아의 생리학에 열쇠가 될 수 있고 일반적으로 미생물 지역 사회 또는 숙주 유기체에 있는 다른 유기체에 의해 제공됩니다. 예를 들어, 뮤신과 같은 복잡한 탄수화물은 동물 호스트에 의해 제공 될 수있다. 이를 미디어에 추가하면 아크케르만시아 무키니필라와 무키니보란히루디니스2,3,4등동물 용기에서 여러 박테리아를 재배할 수 있게 되었다. 많은 병원성 박테리아는 경구 병원체 포르피로모나스 치글리발리스5를포함하여 동물 세포에서 헤민에 결합된 철을 사용하는 능력을 진화하였다. 실험실에서, 포르피로모나스 및 기타 유기체의 성장은, 헤민6의첨가에 의해 자극될 수 있다.
최근, 박테리아의 새로운 분리를 배양에 많은 돌파구는 공동 배양을 통해 왔다, “피더” 유기체를 사용 하 여 그들의 성장에 필요한 비 배양 박테리아에 특정 요소를 제공. Vartoukian와 동료에 의해 우아한 연구 보여주었다 사이드 로포어, 박테리아에 의해 생산 된 철 바인딩 분자, 여러 새로운 경구 분리의 성장을 자극. 피오버딘, 의사 모나드 종에 의해 생성 된 사이드 로포의유형, 크게 새로운 Prevotella 종7의성장을 용이하게하기 위해 표시되었다. 같은 연구에서, 필럼 클로로플렉시를 위한 첫 번째 경구 분리는 또한 F. 뉴클레아텀을 사용하여 아직 알려지지 않은 화합물7을제공하는 도우미로 사용되었다. 최근에는 루미노구카아아속의 박테리아가 세균성 연약증을 사용하여 조력유기로서 8을 분리했다. 그것은 나중에 감마 aminobutyric 산 (GABA), 억제 신경 전달 물질, 실험실 미디어에 성장에 대 한 필요 했다 표시 되었다. 피더 유기체를 사용하는 것은 배양되지 않은 박테리아가 성장하는 특정 미세 환경을 모방하는 핵심 전략으로 입증되었으며, 다양한 농도에서 다양한 첨가제로 성장 미디어를 지속적으로 재구성하는 것보다 더 효율적입니다.
비배양박테리아의 가장 큰 그룹 중 하나는 “후보 필라 방사선”(CPR)에 있으며, 여러 후보 세균성 필라9,10의단피성 그룹이다. 이 글을 쓰는 시점에서, 심폐소생술 내의 사카리박테리아 피럼의 구성원만이 실험실에서 성공적으로 배양되었습니다. 첫 번째 분리인‘나노신박터 리티쿠스’ 균주 TM7x는 비배양식 TM711,12에대한 농축이 예상되었던 항생제 연쇄상 구균증을 사용하여 격리되었다. 이 작품의 주요 발견은 새로운 분리가 세균 호스트, Schaalia odontolytica와의직접 접촉에서 성장하는 기생충으로 성장했다, 현미경 검사는 이러한 기생충이 초소형 박테리아것을 보여 주었다.
이러한 단서를 사용하여, 우리는 신속하게 0.2 μm 필터를 통해 치과 플라크 및 기타 구강 샘플을 필터링하여 파트너와 사카리박테리아의 이진 공동 문화를 설정하는 방법을 고안, 원심 분리에 의해 여과에 세포를 수집하고 후보 호스트 박테리아의 문화를 감염하는 데 사용. 이 방법은 빠르게 성장하는 유기체에 압도 될 수있는 농축 문화를 피하는 장점이 있습니다. 그것은 또한 항생제의 사용을 방지, 대상 된 사카리 박테리아 종 또는 그들의 호스트의 성장을 중지 할 수 있는. 여기에서 입증된 방법을 사용하여, 우리는 성공적으로 사카리박테리아 낭직에서 32개의 분리를 배양했습니다.
플라크를 필터링하고 숙주 생물의 순수한 배양에 적용하는 우리의 방법은 주로 첫 번째 배양 사카리박테리아에 대한 이전의 관찰에 기초,‘나노 신박터 lyticus’ 균주 TM7x11,14,15. 작은 세포 크기를 감안할 때, 우리는 필터를 사용하여 치과 플라크에서 분리되고 원심 분리로 농축 될 수 있다고 추론했습니다. 둘째, 이러한 유기체가 기생충으로 살아 가면서 이러한 세포에게 숙주의 순수한 배양을 제공함으로써 공생에 들어가 이진 배양으로 성장할 수 있습니다.
이 방법의 한 가지 장점은 농축 배양이나 선택적 압력이 필요하지 않다는 것입니다. ‘나노신박터 리티쿠스’ 균주 TM7x는 선택적 제제로서 연쇄절제술을 이용한 농축 배양으로부터 배양되었으며, 시퀀싱은 사카리박테리아의 농축에 효과적일 것이라고 제안했다. 다행히도,‘나노신박터 리티쿠스’ 샤알리아 오돈토리티카의호스트는 연쇄상 구균16에저항하는 것으로 알려져 있다. 선택적 에이전트로 항생제를 사용 하 여 또한 성장에서 호스트 유기 체를 방지할 수 있습니다., 차례로 사카리박테리아의 성장을 배제 것 이다.
농축 문화를 사용하는 더 큰 문제는 빠르게 성장하는 유기체가 빠르게 관심있는 유기체를 대체할 것이라는 것입니다. 구강 부양에서, 예를 들어, 연쇄상 구균 종은 빠르게 성장할 수 있고, 설탕이 성장 매체에 존재하는 경우에, 매체를 산성화하기에 충분한 산을 생성하고, 관심있는 유기체에 대하여 추가 선택합니다. 농축 문화와 선택적 항생제를 피함으로써, 우리의 방법은 이러한 다른 방법의 합병증없이 사카리박테리아와 잠재적 인 호스트의 넓은 범위에 적용 될 수있는 일반적인 접근 방식을 제공합니다.
여기에 제시 된 방법에 몇 가지 장애물이 있습니다. 첫째,이 방법은 사카리박테리아가 이진 문화에 살고 있다고 가정합니다. 우리는 그들의 효과를 측정하기 위하여 trinary 또는 대동맥 문화의 조합을 시험하지 않았습니다, 그러나 단 하나 숙주 유기체가 공급할 수 없는 성장 인자를 요구하는 가능성이 Saccharibacteria가 있습니다. 사카리박테리아의 성장을 지원할 수 있는 구강 박테리아의 광대 한 조합을 테스트 하는 것은 어려운 작업이 될 것입니다. 둘째, 이 방법은 모든 사카리박테리아가 0.2 μm 필터를 통과할 만큼 작다고 가정합니다. 다른 사카리박테리아가 믿는 것보다 크고 필터가 이러한 유기체에 대해 선택할 수 있습니다. 더 큰 공공 크기를 가진 필터를 사용할 수 있습니다., 하지만이 감염 된 공동 배양에 더 원치 않는 구두 박테리아를 허용의 위험을 실행. 마지막으로, 이미 출판 된 것 이외의 호스트 종을 찾는 것은 매우 어렵습니다. 지금까지, 유일한 성공적인 호스트는 제네라 액티노미세, 샤알리아, 아라크니아 및 셀룰로시마이크로움의종이며, 모든 구성원은 필럼 액티노박테리아15,17,18이다. 그러나, 이러한 호스트는 특정 사카리박테리아의 성장을 지원합니다. 사카리박테리아의 더 많은 종을 문화하기 위해 더 많은 호스트를 탐구해야합니다.
우리는 여기에 제시 된 방법이 사카리박테리아와 다른 심폐 소생술 생물의 미래 연구를 도울 수 있기를 바랍니다. 메타게노믹 시퀀싱은 이러한 유기체가 또한 작은 게놈을 가지고 있으며 공생으로 의심되거나 그들의 생존에 중요한 대사 산물 및 그밖 요인을 공급하기 위하여 현지 미생물 공동체에 의지한다는 것을 건의합니다19. 유사한 필터링 전략은 충분히 작고 숙주 유기체가 배양 될 수 있다면 이러한 유기체를 격리하는 데 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 실험실 문화의 강력한 도구를 이 크고 다양한 박테리아 그룹에 가져오는 첫 번째 단계입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 앤 태너, 브루스 파스터, 하이케 보이스버트, 쉬송 그와 바트빌리그 보에게 도움이 되는 토론과 세균균을 제공한 것에 대해 감사를 표하고자 합니다. 우리는 미생물 기술 지원을 수잔 요스트와 제시카 우즈에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수여 번호 R37 DE016937 (연준), R01 DE024468 (연준) 및 T32 DE007327 (AJC)의 밑에 건강의 국가 학회의 치과 및 두개골 면연구의 국립 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |