सार्स-सीओवी-2 का पता लगाना छद्म वायरस संक्रमण के उच्च थ्रूपुट फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके एंटीबॉडी को बेअसर करना
Summary
यहां वर्णित प्रोटोकॉल में स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन के साथ एक उन्नत हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल वेसिकुलर स्टोमाइटिस वायरस छद्म द्वारा संक्रमण को बाधित करने के लिए convalescent सीरम नमूनों की क्षमता का मूल्यांकन करके सार्स-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए एक तेज और प्रभावी विधि की रूपरेखा तैयार की गई है ।
Abstract
चूंकि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) के कारण होने वाली COVID-19 महामारी विकसित होती जा रही है, इसलिए यह स्पष्ट हो गया है कि वायरस के खिलाफ एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति भविष्य के संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा प्रदान कर सकती है। इस प्रकार, प्रभावी COVID-19 टीकों के निर्माण और अनुवाद के रूप में एक अभूतपूर्व गति से जारी है, तेजी से और प्रभावी तरीकों के विकास के लिए सार्स-CoV-2 के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए तेजी से दोनों पहले संक्रमित और प्रतिरक्षित व्यक्तियों के लिए संक्रमण के खिलाफ दीर्घकालिक सुरक्षा निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । यह पत्र उन रोगियों से convalescent सीरम में एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति को मापने के लिए सार्स-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन के साथ वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी) छद्मता का उपयोग करके एक उच्च थ्रूपुट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो हाल ही में COVID-19 से बरामद हुए हैं । एक प्रतिकृति छद्मटाइप वायरस का उपयोग सार्स-सीओवी-2 हैंडलिंग के लिए आवश्यक रोकथाम स्तर 3 सुविधा की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे यह प्रोटोकॉल लगभग किसी भी रोकथाम स्तर 2 प्रयोगशाला के लिए सुलभ हो जाता है। एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग कई नमूनों के लिए 24 घंटे के एक छोटे बदलाव के समय के साथ एक ही समय में चलाने के लिए अनुमति देता है।
Introduction
दिसंबर 2019 में, एक नॉवल कोरोनावायरस की पहचान की गई थी, जिसे अब हम सार्स-सीओवी-2 के रूप में जानते हैं, जो कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19)1के कारक एजेंट हैं। सार्स-सीओवी-2 कोरोनाविराइडी परिवार से संबंधित एक बीटाकोरोनावायरस है। इन छा वायरस एक बड़े सकारात्मक भावना आरएनए जीनोम शामिल है और दोनों मनुष्यों और जानवरों में श्वसन और आंतों के संक्रमण के लिए जिंमेदार है2। मई 2021 तक विश्व स्तर पर COVID-19 के 157 मिलियन से अधिक मामले सामने आए हैं और 3.2 मिलियन से अधिक मौतेंहुई हैं। एक प्रभावी टीके का विकास दुनिया भर के शोधकर्ताओं का प्राथमिक लक्ष्य बन गया है जिसमें जांच के तहत कम से कम 77 प्रीक्लीनिकल टीके और वर्तमान में नैदानिक परीक्षण 4 से गुजर रहेहैं।
कोरोनावायरस स्पाइक प्रोटीन (एस), न्यूक्लियोकैप्सिड (एन), लिफाफा प्रोटीन (ई), और झिल्ली प्रोटीन (एम) सहित चार संरचनात्मक प्रोटीन को एन्कोड करता है। सार्स-सीओवी-2 के प्रवेश के लिए मेजबान रिसेप्टर, मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसी2) के साथ एस के रिसेप्टर-बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी) की बातचीत की आवश्यकता होती है, और बाद में झिल्ली संलयन मेजबान सेलुलर सेरीन प्रोटीज, ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीज सेरीन 2(TMPRSS2)5,6,7,8,9, 10,10 द्वारा प्रोटियोलिटिक क्लीमेंट के बाद . सार्स-सीओवी के एस प्रोटीन के विनोदी इम्यूनोडोमिनेंस की पहले रिपोर्ट की गई है और अब सार्स-सीओवी-211, 12,13के लिए भी दिखाया गया है । दरअसल, एस के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को बेअसर सार्स-CoV रोगियों से convalescent सीरम में 24 महीने संक्रमण के बाद14का पता चला है, दीर्घकालिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला । एस प्रोटीन की पहचान एक आशाजनक टीके लक्ष्य के रूप में की गई है और इस प्रकार यह विकास15,16के तहत अधिकांश टीकों का एक प्रमुख घटक बन गया है ।
जबकि एंटीबॉडी को बेअसर करने का तेजी से पता लगाना वैक्सीन विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू है, यह प्रभावित क्षेत्रों में संक्रमण और सेरो-महामारी विज्ञान निगरानी की दर पर प्रकाश भी डाल सकता है17। सरस-सीओवी-2 एस ग्लाइकोप्रोटीन के साथ एक प्रतिकृति-सक्षम वीएसवी छद्म रूप, जंगली प्रकार के वीएसवी ग्लाइकोप्रोटीन के स्थान पर, जैवसेफ्टी स्तर 2 सेटिंग्स में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए कृपया व्हेलन और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा दान किया गया था18। वीएसवी एक्सप्रेसिंग स्पाइक (वीएसवी-एस) का उपयोग सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन के खिलाफ बेअसर एंटीबॉडी प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। जैसा कि वीएसवी-एस ने यहां उपयोग किया जाता है, संक्रमण की मात्रा निर्धारित करने के लिए 24 घंटे के भीतर ईजीएफपी फोसी का पता लगाया जा सकता है, जबकि पट्टिका गठन में 48 से 72 घंटे लग सकते हैं। संक्षेप यहां वीएसवी-एस-ईजीएफपी संक्रमण को बेअसर करने के लिए convalescent रोगी सीरम की क्षमता निर्धारित करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल है। इस विधि को अन्य संभावित चिकित्सीय से पूछताछ करने के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उद्देश्य सार्स-सीओवी-2 एस प्रोटीन की मेजबानी-वायरल बातचीत को बाधित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि को आवश्यकतानुसार अलग-अलग प्रयोगशाला वातावरण और संसाधनों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा एक रोकथाम स्तर 2 अंतरिक्ष और ऊतक संस्कृति हुड क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उदारता से इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल VSV-S-eGFP वायरस प्रदान करने के लिए Whelan प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते है (मामले एट अल २०२० में वर्णित) । हम रोगी रक्त नमूनों (आरईबी प्रोटोकॉल आईडी 20200371-01H) को इकट्ठा करने के लिए डीआरएस बिल कैमरन और जुथापोर्न काउअन (और टीम) को भी धन्यवाद देते हैं। लेखकों अनुसंधान, लेखकत्व के लिए निम्नलिखित वित्तीय सहायता की प्राप्ति 448323 का खुलासा, और/ जेपी एक क्लस्टर Mitacs फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है। टीएचए को सीआईएआर बैंटिंग फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम उन सभी व्यक्तियों को भी धन्यवाद देना चाहेंगे जिन्होंने इस अध्ययन के लिए भाग लिया और अपने रक्त नमूने दान किए ।
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
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