Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion
Summary
Den protokol, der er beskrevet her skitserer en hurtig og effektiv metode til måling neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 spike protein ved at evaluere evnen af rekonvalescerende serum prøver til at hæmme infektion med en forbedret grøn fluorescerende protein-mærket vesikulær stomatitis virus pseudotypeeret med spike glycoprotein.
Abstract
I takt med at COVID-19-pandemien forårsaget af alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) fortsætter med at udvikle sig, er det blevet tydeligt, at tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer mod virusset kan give beskyttelse mod fremtidig infektion. Efterhånden som oprettelsen og oversættelsen af effektive COVID-19-vacciner fortsætter med et hidtil uset tempo, vil udviklingen af hurtige og effektive metoder til måling af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 blive stadig vigtigere for at bestemme langsigtet beskyttelse mod infektion for både tidligere smittede og immuniserede individer. Dette papir beskriver en protokol med høj gennemløb ved hjælp af vesikulær stomatitisvirus (VSV), der er pseudotypen med SARS-CoV-2 spikeproteinet for at måle tilstedeværelsen af neutraliserende antistoffer i rekonvalescent serum fra patienter, der for nylig er kommet sig efter COVID-19. Brugen af en replikerende pseudotypevirus eliminerer behovet for en indeslutningsniveau 3-facilitet, der kræves til SARS-CoV-2-håndtering, hvilket gør denne protokol tilgængelig for stort set ethvert indeslutningsniveau 2-laboratorium. Brugen af et 96-brønds format gør det muligt at køre mange prøver på samme tid med en kort ekspeditionstid på 24 timer.
Introduction
I december 2019 blev der konstateret en ny coronavirus, som vi nu kender som SARS-CoV-2, der er årsagsmidlet til coronavirussen 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 er en betacoronavirus, der tilhører Coronaviridae-familien. Disse indhyllede vira omfatter et stort RNA-genom med positiv sans og er ansvarlige for luft- og tarminfektioner hos både mennesker og dyr2. I maj 2021 har der været mere end 157 millioner rapporterede tilfælde af covid-19 globalt og mere end 3,2 millioner dødsfald3. Udviklingen af en effektiv vaccine er blevet det primære mål for forskere over hele kloden med mindst 77 prækliniske vacciner under undersøgelse og 90 i øjeblikket gennemgår kliniske forsøg4.
Coronavirusser koder fire strukturelle proteiner, herunder spikeproteinet (S), nukleocapsid (N), konvolutprotein (E) og membranproteinet (M). Indtastning af SARS-CoV-2 kræver interaktion mellem det receptorbindende domæne (RBD) i S med værtsreceptoren, human angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) og efterfølgende membranfusion efter proteolytisk kavalergang ved værts cellulær serineprotease, transmembran protease serin 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Humoristisk immundominanceans af S-proteinet af SARS-CoV er tidligere blevet rapporteret og er nu også blevet vist for SARS-CoV-211,12,13. Faktisk er neutraliserende antistofresponser mod S blevet påvist i rekonvalescent serum fra SARS-CoV-patienter 24 måneder efter infektion14, hvilket fremhæver deres kritiske rolle i det langsigtede immunrespons. S-proteinet er blevet identificeret som et lovende vaccinemål og er således blevet en nøglekomponent i de fleste vacciner under udvikling15,16.
Mens den hurtige påvisning af neutraliserende antistoffer er et kritisk aspekt af vaccineudviklingen, kan det også kaste lys over infektionsraten og sero-epidemiologisk overvågning i påvirkede områder17. En replikation-kompetent VSV pseudotyped med SARS-CoV-2 S glycoprotein, i stedet for den vilde type VSV glycoprotein, at studere SARS-CoV-2 infektion i biosikkerhed niveau 2 indstillinger blev venligt doneret af Whelan og kolleger18. VSV udtrykke spike (VSV-S) vil blive udnyttet til at bestemme neutralisere antistofrespons mod SARS-CoV-2 spike protein. Da VSV-S, der anvendes her, også udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP), kan eGFP foci påvises inden for 24 timer for at kvantificere infektion, mens plaquedannelse kan tage 48 til 72 timer. Sammenfattet her er en enkel og effektiv protokol til at bestemme evnen til rekonvalescent patient serum til at neutralisere VSV-S-eGFP infektion. Denne metode kan også let tilpasses til at afhøre andre potentielle terapeutiske midler, der har til formål at forstyrre værts-viral interaktion af SARS-CoV-2 S protein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metode, der er beskrevet her, kan tilpasses til forskellige laboratoriemiljøer og ressourcer efter behov. Vigtigere, den vigtigste begrænsning af denne protokol er nødvendigheden af en indeslutning niveau 2 rum-og væv kultur hætte. Anvendelsen af en replikerende RNA-virus, der er pseudotype med SARS-CoV-2-spiken, såsom VSV-S-eGFP, er et formidabelt alternativ til SARS-CoV-2-virus, som kræver et indeslutningsniveau 3-arbejdsområde, men kan forblive en begrænsning for nogle grupper. Alle andre trin, der er bes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Whelan-laboratoriet for generøst at levere VSV-S-eGFP-virus, der anvendes i denne protokol (beskrevet i sag et al. 2020). Vi takker også Drs. Bill Cameron og Juthaporn Cowan (og team) for at indsamle patientens blodprøver (REB protokol ID 20200371-01H). Forfatterne afslører modtagelsen af følgende økonomiske støtte til forskning, forfatterskab og / eller offentliggørelse af denne artikel: Dette arbejde blev finansieret af den generøse støtte fra Ottawa Hospital Foundation og et tilskud fra canadian Institutes of Health Research (# 448323) og et Fast Grant fra Thistledown foundation for COVID-19 Science til C.S.I. T.R.J. er finansieret af et Ontario Graduate Scholarship og cluster Mitacs stipendium. JP er finansieret af en klynge Mitacs stipendium. T.A. er finansieret af en CIHR Banting Fellowship. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
Riferimenti
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
