Påvisning af SARS-CoV-2 receptorbindende domæneantistof ved hjælp af en HiBiT-baseret bioreporter
Summary
Den skitserede protokol beskriver proceduren for fremstilling af HiBiT-receptorbindende domæneproteinkompleks og dets anvendelse til hurtig og følsom påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer.
Abstract
Fremkomsten af COVID-19-pandemien har øget behovet for bedre serologiske påvisningsmetoder til at bestemme de epidemiologiske virkninger af svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Det stigende antal SARS-CoV-2-infektioner øger behovet for bedre antistofdetekteringsanalyser. De nuværende metoder til antistofdetektion kompromitterer følsomheden for hastighed eller er følsomme, men tidskrævende. En stor del af SARS-CoV-2-neutraliserende antistoffer er rettet mod det receptorbindende domæne (RBD), et af de primære immunogene rum i SARS-CoV-2. Vi har for nylig designet og udviklet en meget følsom, bioluminescerende-mærket RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) til at opdage SARS-CoV-2 antistoffer. I følgende tekst beskrives proceduren for fremstilling af HiBiT-RBD-komplekset og en hurtig analyse for at evaluere tilstedeværelsen af RBD-målretningsantistoffer ved hjælp af dette værktøj. På grund af holdbarheden af HiBiT-RBD-proteinproduktet over en lang række temperaturer og den kortere forsøgsprocedure, der kan afsluttes inden for 1 time, kan protokollen betragtes som et mere effektivt alternativ til påvisning af SARS-CoV-2 antistoffer i patient serumprøver.
Introduction
Den nylige fremkomst af et nyt coronavirus, SARS-CoV21, har forårsaget mere end 2.800.000 dødsfald og 128 millioner infektioner pr. 30. marts 20212. På grund af manglen på en pålidelig og veletableret behandlingsprocedure for sars-CoV-2 kliniske behandlinger, mange bestræbelser er blevet gjort for at begrænse yderligere viral transmission og endnu vigtigere, at udvikle en effektiv og robust behandling eller en vaccine3. Til dato er der mere end 50 covid-19-vaccinekandidater i forsøg rapporteret af Verdenssundhedsorganisationen4. Påvisning af antistoffer mod SARS-CoV-2 er af afgørende betydning for at bestemme den langsigtede stabilitet af humoral respons ved administration af vaccinen samt hos genvundne patienter med COVID-195. Nogle undersøgelser har vist, at der er en mulighed for, at genvundne SARS-CoV-2-patienter mister de fleste af de RBD-bindende antistoffer efter 1 år5,6,7,8,9. Yderligere undersøgelser er nødvendige for bedre at forstå varig immunitet, og mere følsomme antistofdetekteringsplatforme kan bidrage til at fremme et sådant arbejde. Rapporter om vedvarende immunitet af milde SARS-CoV-2 infektioner, som tyder på langsigtede antistofresponser, er også et interessant og værdifuldt studieområde. En hurtig og præcis metode til påvisning er afgørende for overvågning af antistoffer i enkeltpersoners sera for at give mere information om immunitet i befolkningen.
Ligesom andre coronavirusser bruger SARS-CoV-2 fremspringende spike glycoprotein til at binde sig til angiotensinkonverterende enzym-2 (ACE2) til at indlede en kaskade af begivenheder, der fører til fusion af virus- og cellemembranerne6,7. Flere undersøgelser har for nylig vist, at RBD af Spike-proteinet har en afgørende rolle i fremkalde kraftig og specifik antistofrespons mod SARS-CoV28,9,10,11. Navnlig er korrelationer observeret af Premkumar et al. mellem titeren af RBD-bindende antistof og SARS-CoV-2-neutraliseringsstyrken af patienternes plasma i overensstemmelse med, at RBD er et immunogent rum i virusstrukturen9. Med dette in mente er mange diagnostiske test, der er tilgængelige for SARS-CoV-2-antistofdetektering, tids- og omkostningskrævende, kræver en langvarig procedure for inkubation og vask (enzymrelateret immunosorbentanalyse [ELISA]) eller mangler følsomhed og nøjagtighed (lateral flow immunoassay [LFIA])12. Derfor vil en kvantitativ og hurtig supplerende serologisk metode til covid-19-afledt antistofdetektering med høj følsomhed, hurtig respons og relativt lave omkostninger tjene behovet for en pålidelig serologisk test for SARS-CoV-2 epidemiologisk overvågning.
Samlet set førte begrænsningerne i de nuværende serologiske analyser til en undersøgelse af det bioluminescerende rapporteringssystem som et potentielt diagnostisk middel i fremtidige serosurveyer. Bioluminescens er en naturligt forekommende enzym/substratreaktion med let emission. Nanoluc luciferase er den mindste (19 kDa), men det klareste system sammenlignet med Renilla og firefly luciferase (henholdsvis 36 kDa og 61 kDa)13,14. Desuden har Nanoluc det højeste signal til støjforhold og stabilitet blandt de tidligere nævnte systemer. Nanoluc’s høje signalintensitet understøtter påvisning af selv meget lave mængder af reporterfusioner15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) er en opdelt version af Nanoluc-systemet, som består af to segmenter: små BiT (11 aminosyrer; SmBiT) og stor bit (LgBiT) med relativt lav-affinitet interaktioner (KD = 190 μM) til at danne en selvlysende kompleks16. NanoBiT anvendes i vid udstrækning i forskellige undersøgelser, der involverer identifikation af protein-protein interaktioner15,17,18,19 og cellulære signaleringsveje11,20,21.
For nylig blev en anden lille peptid med en udpræget højere affinitet til LgBiT (KD = 0,7 nM) indført, nemlig HiBiT Nano-Glo-systemet i stedet for SmBiT. Den høje affinitet og stærke signal af Nano-Glo “add-mix-read” assay gør HiBiT en passende, kvantitativ, selvlysende peptid tag. I denne tilgang er HiBiT-mærket vedhæftet målproteinet ved at udvikle en konstruktion, der pålægger minimal strukturel interferens. HiBiT-protein fusion ville aktivt binde sig til LgBiT modstykke, der producerer en meget aktiv luciferase enzym til at generere påviselig bioluminescens i overværelse af detektion reagenser (Figur 1). På samme måde udviklede vi et HiBiT Nano-Glo-baseret system til let at måle den neutraliserende antistof titer i sera af SARS-CoV-2 genvundne individer og udviklede for nylig en HiBiT-mærket SARS-CoV-2 RBD. Dette papir beskriver protokollen til fremstilling af HiBiT-RBD bioreporter ved hjælp af standard laboratorieprocedurer og udstyr, og viser, hvordan denne bioreporter kan bruges i en hurtig og effektiv analyse til at opdage SARS-CoV-2 RBD-målretning antistoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det stigende antal personer, der er smittet med SARS-CoV-2, og den igangværende indsats for global vaccination kræver følsomme og hurtige serologiske tests, der kan bruges i store serosurveyer. Nyere forskning viser, at split nanoluciferase-baserede bioreportere kan bruges til at udvikle sådanne analyser. Vi har for nylig udviklet HiBiT-RBD bioreporter til at designe en test, der kan bruges til at opdage SARS-CoV-2-specifikke antistoffer i patientens serum på en hurtig og pålidelig måde (Figur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på og takker den tekniske bistand fra Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin og Christiano Tanese De Souza. Vi takker også Mina Ghahremani for grafisk design. Vi vil også gerne takke alle de personer, der deltog og donerede deres blodprøver til denne undersøgelse. DWC støttes delvist af uOttawa Fakultet og Institut for Medicin.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
Riferimenti
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
