La méthode décrite ici est établie pour déterminer l’étendue de la restriction du VIH-1 par la protéine inhibitrice cellulaire SAMHD1. Les cellules U937 de la lignée myéloïde humaine sont transduites avec un vecteur d’expression SAMHD1 co-exprimant YFP, différenciées puis contestées avec la RFP VIH. Le niveau de restriction est déterminé par analyse par cytométrie de flux.
La protéine 1 stérile contenant le domaine α-motif/histidine-aspartate (SAMHD1) inhibe la réplication du VIH-1 dans les cellules myéloïdes quiescentes. Les cellules U937 sont largement utilisées comme système cellulaire pratique pour analyser l’activité SAMHD1 en raison d’un faible niveau d’expression de l’ARN SAMHD1, conduisant à une expression indétectable de protéines endogènes. Sur la base de tests similaires développés dans le laboratoire Stoye pour caractériser d’autres facteurs de restriction rétrovirale, le laboratoire Bishop a développé un test de restriction bicolore pour analyser SAMHD1 dans les cellules U937. Les particules de type virus de la leucémie murine exprimant SAMHD1, aux côtés de YFP exprimé à partir d’un IRES, sont utilisées pour transduire les cellules U937. Les cellules sont ensuite traitées avec de l’acétate de myristate de phorbol pour induire la différenciation en un phénotype quiescent. Après différenciation, les cellules sont infectées par des particules semblables au virus VIH-1 exprimant un rapporteur fluorescent. Après 48 h, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux. La proportion de cellules infectées par le VIH dans la population exprimant SAMHD1 est comparée à celle des cellules témoins internes dépourvues de SAMHD1. Cette comparaison révèle un taux de restriction. L’expression de SAMHD1 conduit à une réduction de cinq fois de l’infection par le VIH, ce qui correspond à un rapport de restriction de 0,2. Notre récente substitution de la DP à la GFP originale en tant que gène rapporteur de l’infection par le VIH a facilité l’analyse de la cytométrie en flux.
Ce test a été utilisé avec succès pour caractériser l’effet des substitutions d’acides aminés sur la restriction SAMHD1 en transduisant avec des virus codant pour des protéines SAMHD1 altérées, dérivées de la mutagénèse dirigée du vecteur d’expression. Par exemple, les substitutions catalytiques de sites HD206-7AA montrent un phénotype de restriction de 1, indiquant une perte d’activité de restriction. De même, la sensibilité de différents virus testeurs peut être déterminée. Le test peut être adapté pour intégrer l’effet du statut de différenciation, du statut métabolique et des modificateurs SAMHD1 afin de mieux comprendre la relation entre SAMHD1, l’état métabolique cellulaire et la restriction virale.
La protéine 1 stérile contenant le domaine α-motif/histidine-aspartate (SAMHD1) empêche la réplication du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans les cellules quiescentes de la lignée myéloïde. SAMHD1 bloque la réplication par son activité enzymatique en tant que dNTP triphosphohydrolase, ce qui entraîne une diminution des niveaux de dNTP intracellulaires. En conséquence, le VIH-1 ne peut pas effectuer efficacement le processus de transcription inverse. Beaucoup de progrès ont été réalisés au cours des quelques années qui ont suivi cette première observation, notamment en ce qui concerne la contribution de domaines spécifiques et d’acides aminés à l’activité antivirale de SAMHD1. Ces connaissances ont été faites à l’aide de tests biochimiques ainsi que de systèmes cellulaires imitant l’environnement myéloïde quiescent physiologiquement pertinent. Les cellules U9371 sont largement utilisées comme système cellulaire myéloïde pratique pour analyser l’activité de SAMHD1. Cela est dû à un manque d’expression endogène de SAMHD1, que l’on pense être dû à de faibles niveaux d’ARN par rapport aux cellules exprimant SAMHD1 (un domaine de recherche en cours). Ici, le protocole décrit la transduction transitoire de cellules U937 avec des particules pseudo-virales co-exprimant SAMHD1 et un rapporteur de protéine fluorescente jaune (YFP) pour examiner le mécanisme de restriction SAMHD1 du VIH-1. De tels tests transitoires de cytométrie en flux bicolore pour examiner les restrictions rétrovirales ont d’abord été développés dans le laboratoire Stoye2 et ont depuis été adaptés pour étudier d’autres facteurs de restriction, y compris les protéines à motif tripartite (TRIM)3. Inspiré par ces tests, le laboratoire Bishop a développé un test bicolore pour analyser la restriction SAMHD1 dans les cellules U937.
Le flux de travail de l’expérience est illustré à la figure 1. Des particules de type virus de la leucémie murine (MLV) contenant un message bi-cistronique codant SAMHD1 aux côtés de YFP exprimé à partir d’un IRES sont utilisées pour transduire les cellules U937. Les cellules sont ensuite traitées avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour induire la différenciation en un phénotype quiescent. Les cellules sont ensuite infectées par des particules semblables au virus VIH-1 exprimant la protéine fluorescente rouge (RFP). Après 48 h, les cellules sont récoltées et analysées par cytométrie en flux bicolore. Ce test est également utilisé avec le YFP et la protéine fluorescente verte (GFP), nécessitant moins de combinaisons de filtres standard pour l’analyse de cytométrie en flux. L’utilisation de la DPR VIH permet une compensation plus directe et, par conséquent, le test est plus facilement accessible aux utilisateurs moins expérimentés de la cytométrie en flux et réalisable avec la plupart des cytomètres.
Au cours de l’analyse, la proportion de cellules infectées par le VIH est comparée entre les cellules exprimant SAMHD1 et celles dépourvues de SAMHD1 dans le même puits de cellules. Cela permet un contrôle interne dans le tube de cytométrie puits/flux, ce qui est une caractéristique clé. La comparaison des niveaux d’infection dans les cellules transduites et non transduites révèle un rapport de restriction. Un ratio de 1,0 indique que le facteur transduit n’a aucun effet sur l’infectiosité. L’expression de la SAMHD1 de type sauvage conduit à une réduction de cinq fois de l’infection par le VIH dans ce test, ce qui correspond à un rapport de restriction de 0,2. Bien que cet effet soit modeste par rapport aux facteurs de restriction plus classiques tels que TRIM5, l’effet est néanmoins reproductible et permet de classer les exprimeurs SAMHD1 modifiés en ceux qui restreignent de manière équivalente à la protéine de type sauvage, ceux qui ne restreignent pas et ceux avec un phénotype intermédiaire.
Ce test a été utilisé avec succès pour caractériser le domaine SAMHD1 et les phénotypes de restriction des mutants d’acides aminés en transduisant avec des virus codant pour des séquences SAMHD1 mutantes. Par exemple, les substitutions catalytiques de sites HD206-7AA ne parviennent pas à restreindre dans ce test. De même, la sensibilité de différents virus testeurs peut être déterminée. Par exemple, les mutants de la transcriptase inverse du VIH-1 sont plus sensibles à la restriction médiée par SAMHD1 (p. ex. 151V4). Ce protocole décrit les détails de la production de particules pseudo-virales (PPV), de la transduction de l’U937 avec des vecteurs d’expression SAMHD1, de l’infection par le VIH porteur d’un rapporteur fluorescent et de l’analyse subséquente par cytométrie en flux. Cet article explique à quelles données s’attendre et comment éviter des résultats sous-optimaux. Enfin, d’autres utilisations du test sont décrites, en plus d’examiner différentes variantes de SAMHD1 pour comprendre plus en profondeur l’interaction entre SAMHD1, les niveaux de dNTP et l’infection virale. Compte tenu du rôle de SAMHD1 au centre du métabolisme cellulaire, avec des liens supplémentaires avec le cancer, cela continue d’être un domaine d’intérêt intense.
Comme indiqué dans les notes ci-dessus, les aspects critiques du protocole sont centrés sur la conservation du phénotype cellulaire correct pour la production de PPV et sur la création d’un environnement approprié pour observer la restriction SAMHD1. Tout d’abord, l’analyse précise de la restriction par cytométrie en flux bicolore repose sur l’obtention de proportions appropriées de cellules transduites et infectées afin qu’il y ait suffisamment de cellules dans chaque zone de la parcelle pour l’analyse. En tant que tel, le chercheur devrait viser un MOI inférieur à 1 (voir le protocole). Des taux de transduction et d’infection trop élevés ou trop faibles entraînent des problèmes d’analyse en raison du manque de cellules non infectées ou doublement infectées. De même, un taux de transduction similaire pour les vecteurs SAMHD1 à comparer est essentiel pour permettre d’appliquer la même matrice de compensation et la même grille à l’ensemble de l’expérience, augmentant ainsi la confiance dans l’analyse ultérieure.
Deuxièmement, l’âge des cellules U937 utilisées est un facteur clé pour savoir si elles se différencient avec succès. La différenciation réussie peut être surveillée par l’observation de l’observance, une acidification réduite du milieu au fil du temps après la différenciation et une restriction adéquate par le témoin positif de type sauvage dans l’essai. La différenciation allant jusqu’à 5 jours a été couronnée de succès.
L’un des principaux avantages de ce test est sa flexibilité. Une variété de versions modifiées de SAMHD1 (domaines, acides aminés, séquences d’espèces) peuvent être testées par simple mutagénèse dirigée du vecteur ou clonage. De même, des variantes du virus testeur peuvent être explorées. Le test a déjà été utilisé pour démontrer que les mutants de la transcriptase inverse du VIH-1 ayant une capacité réduite à se lier au dNTP sont plus sensibles à la restriction SAMHD1. Le même principe peut être utilisé pour tester la restriction d’autres virus par SAMHD1. De plus, des conditions de différenciation variables ou une manipulation artificielle des concentrations intracellulaires de dNTP peuvent être utilisées pour sonder davantage l’interaction entre les conditions intracellulaires et l’activité SAMHD1, un domaine de recherche actif dans le laboratoire Bishop. L’interaction de SAMHD1 avec divers inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse a également été décrite, et l’effet de SAMHD1 montré à l’aide de ce test modifié pour une utilisation dans les cellules primaires12,13,14,15.
L’adaptation du protocole pour une utilisation dans les cellules primaires surmonte la limitation posée par l’examen des phénotypes métaboliques dans les cellules transformées. Cependant, le format existant permet un protocole pratique et moins difficile techniquement pour l’analyse à haut débit, en particulier avec l’utilisation d’un cytomètre en flux avec un échantillonneur à haut débit. Lors de l’adaptation du protocole, la sensibilité des cellules internes non transduites aux effets secondaires (p. ex. signalisation immunitaire) doit être prise en compte.
Comme pour de nombreux aspects de la biologie cellulaire, il est essentiel que de tels tests soient utilisés dans le cadre d’une approche holistique pour comprendre un phénomène donné. L’utilisation parallèle de tests biochimiques pour l’activité SAMHD116, la quantification des pools intracellulaires de dNTP et l’observation des phénotypes mutants SAMHD1 chez l’homme, ex vivo et dans des modèles animaux (menées par des laboratoires du monde entier, dont certains sont décrits dans ce numéro) sont essentielles à l’évolution de la compréhension de cette protéine complexe.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Francis Crick Institute, qui reçoit son financement de base de Cancer Research UK (FC001042 et FC001162), le UK Medical Research Council (FC001042 et FC001162) et le Wellcome Trust (FC001042 et FC001162) et par une bourse Wellcome Trust Investigator Award à JPS (108012/Z/15/Z). Les travaux à l’Université de Cambridge ont été cofinancés par le Centre de recherche biomédicale de Cambridge du NIHR, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) et le Medical Research Council du Royaume-Uni (MR/S009752/1). Ce dernier prix, financé par le Royaume-Uni, fait partie du programme EDCTP2 soutenu par l’Union européenne.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |