Hier wird eine etablierte Methode beschrieben, um das Ausmaß der HIV-1-Restriktion durch das zelluläre hemmende Protein SAMHD1 zu bestimmen. Humane myeloische U937-Zellen werden mit einem SAMHD1-Expressionsvektor transduziert, der YFP co-exprimiert, differenziert und dann mit HIV-RFP herausgefordert wird. Der Grad der Einschränkung wird durch Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) hemmt die Replikation von HIV-1 in ruhenden myeloischen Zellen. U937-Zellen werden aufgrund einer geringen SAMHD1-RNA-Expression häufig als praktisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet, was zu einer nicht nachweisbaren endogenen Proteinexpression führt. Basierend auf ähnlichen Assays, die im Stoye-Labor zur Charakterisierung anderer retroviraler Restriktionsfaktoren entwickelt wurden, entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Restriktionsassay zur Analyse von SAMHD1 in U937-Zellen. Murine Leukämie Virus-ähnliche Partikel, die SAMHD1 exprimieren, werden zusammen mit YFP, das von einem IRES exprimiert wird, verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Nach der Differenzierung werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die einen fluoreszierenden Reporter exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil der HIV-infizierten Zellen in der SAMHD1-exprimierenden Population wird mit dem in internen Kontrollzellen verglichen, denen SAMHD1 fehlt. Dieser Vergleich zeigt ein Restriktionsverhältnis. Die SAMHD1-Expression führt zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Unsere jüngste Substitution von RFP durch das ursprüngliche GFP als Reportergen für HIV-Infektionen hat die Durchflusszytometrie-Analyse erleichtert.
Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen auf die SAMHD1-Restriktion zu charakterisieren, indem mit Viren transformiert wurde, die für veränderte SAMHD1-Proteine kodieren, die aus der ortsgerichteten Mutagenese des Expressionsvektors abgeleitet wurden. Zum Beispiel zeigen die katalytischen Stellensubstitutionen HD206-7AA einen Restriktionsphänotyp von 1, was auf einen Verlust der Restriktionsaktivität hinweist. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Der Assay kann weiter angepasst werden, um die Wirkung von Differenzierungsstatus, metabolischem Status und SAMHD1-Modifikatoren zu berücksichtigen, um die Beziehung zwischen SAMHD1, Zellstoffwechselzustand und viraler Restriktion besser zu verstehen.
Steriles α-Motiv/Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) behindert die Replikation des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) in ruhenden Zellen der myeloischen Linie. SAMHD1 blockiert die Replikation durch seine enzymatische Aktivität als dNTP-Triphosphohydrolase, was zu verminderten intrazellulären dNTPs führt. Infolgedessen kann HIV-1 den Prozess der reversen Transkription nicht effizient durchführen. In den wenigen Jahren seit dieser ersten Beobachtung wurden große Fortschritte erzielt, insbesondere in Bezug auf den Beitrag bestimmter Domänen und Aminosäuren zur antiviralen Aktivität von SAMHD1. Diese Erkenntnisse wurden mit biochemischen Assays sowie Zellsystemen gewonnen, die die physiologisch relevante ruhende myeloische Umgebung nachahmen. U937-Zellen1 werden häufig als praktisches myeloisches Zellsystem zur Analyse der SAMHD1-Aktivität verwendet. Dies ist auf einen Mangel an endogener SAMHD1-Expression zurückzuführen, von dem angenommen wird, dass er auf niedrige RNA-Spiegel im Vergleich zu SAMHD1-exprimierenden Zellen zurückzuführen ist (ein Bereich der laufenden Forschung). Hier beschreibt das Protokoll die transiente Transduktion von U937-Zellen mit virusähnlichen Partikeln, die SAMHD1 co-exprimieren, und einem Yellow Fluorescent Protein (YFP)-Reporter, um den Mechanismus der SAMHD1-Restriktion von HIV-1 zu untersuchen. Solche transienten zweifarbigen Durchflusszytometrie-Assays zur Untersuchung retroviraler Restriktionen wurden zuerst im Stoye-Labor2 entwickelt und seitdem angepasst, um andere Restriktionsfaktoren zu untersuchen, einschließlich der Tripartite Motif (TRIM) Proteine3. Inspiriert von diesen Assays entwickelte das Bishop-Labor einen zweifarbigen Assay zur Analyse der SAMHD1-Restriktion in U937-Zellen.
Der Workflow für das Experiment ist in Abbildung 1 dargestellt. Murine Leukämie Virus (MLV)-ähnliche Partikel, die eine bi-cistronische Nachricht enthalten, die SAMHD1 neben YFP kodiert, das von einem IRES exprimiert wird, werden verwendet, um U937-Zellen zu transduzieren. Die Zellen werden dann mit Phorbolmyristatacetat (PMA) behandelt, um eine Differenzierung zu einem ruhenden Phänotyp zu induzieren. Als nächstes werden Zellen mit HIV-1-Virus-ähnlichen Partikeln infiziert, die rotes fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren. Nach 48 h werden die Zellen geerntet und mittels Zweifarben-Durchflusszytometrie analysiert. Dieser Assay wird auch mit YFP und grün fluoreszierendem Protein (GFP) verwendet, wodurch weniger Standardfilterkombinationen für die Durchflusszytometrie-Analyse erforderlich sind. Die Verwendung von HIV-RFP ermöglicht eine einfachere Kompensation und somit ist der Assay für weniger erfahrene Durchflusszytometrie-Benutzer leichter zugänglich und mit den meisten Zytometern erreichbar.
Während der Analyse wird der Anteil der HIV-infizierten Zellen zwischen SAMHD1-exprimierenden Zellen und solchen, denen SAMHD1 fehlt, innerhalb derselben Zellquelle verglichen. Dies ermöglicht eine interne Kontrolle im Bohrloch-/Durchflusszytometrieröhrchen, was ein Schlüsselmerkmal ist. Der Vergleich der Infektionsraten in transduzierten und nicht transduzierten Zellen zeigt ein Restriktionsverhältnis. Ein Verhältnis von 1,0 zeigt an, dass der transduzierte Faktor keinen Einfluss auf die Infektiosität hat. Die Wildtyp-SAMHD1-Expression führt in diesem Test zu einer fünffachen Reduktion der HIV-Infektion, was einem Restriktionsverhältnis von 0,2 entspricht. Obwohl dieser Effekt im Vergleich zu klassischeren Restriktionsfaktoren wie TRIM5 bescheiden ist, ist der Effekt dennoch reproduzierbar und ermöglicht die Klassifizierung modifizierter SAMHD1-Expressionoren in solche, die sich in äquivalenter Weise auf das Wildtyp-Protein beschränken, solche, die nicht einschränken, und solche mit einem intermediären Phänotyp.
Dieser Assay wurde erfolgreich verwendet, um die Restriktionsphänotypen der SAMHD1-Domäne und der Aminosäuremutanten zu charakterisieren, indem er mit Viren transduzierte, die mutierte SAMHD1-Sequenzen kodieren. Zum Beispiel können die katalytischen Site-Substitutionen HD206-7AA in diesem Assay nicht eingeschränkt werden. Ebenso kann die Anfälligkeit verschiedener Testerviren bestimmt werden. Zum Beispiel sind HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten anfälliger für SAMHD1-vermittelte Restriktion (z. B. 151V4). Dieses Protokoll beschreibt die Details der Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLP), die Transduktion von U937 mit SAMHD1-Expressionsvektoren, die Infektion mit HIV mit einem fluoreszierenden Reporter und die anschließende Analyse mittels Durchflusszytometrie. In diesem Artikel wird erläutert, welche Daten zu erwarten sind und wie suboptimale Ergebnisse vermieden werden können. Schließlich werden alternative Anwendungen für den Assay skizziert, zusätzlich zur Untersuchung verschiedener SAMHD1-Varianten, um das Zusammenspiel zwischen SAMHD1, dNTP-Spiegeln und Virusinfektion gründlicher zu verstehen. Angesichts der Rolle von SAMHD1 im Zentrum des Zellstoffwechsels mit zusätzlichen Verbindungen zu Krebs ist dies weiterhin ein Bereich von intensivem Interesse.
Wie in den obigen Anmerkungen erläutert, konzentrieren sich die kritischen Aspekte des Protokolls auf die Beibehaltung des korrekten Zellphänotyps für die VLP-Produktion und auf die Schaffung einer geeigneten Umgebung für die Beobachtung der SAMHD1-Restriktion. Erstens beruht die genaue Analyse der Restriktion durch Zweifarben-Durchflusszytometrie darauf, angemessene Anteile von transduzierten und infizierten Zellen zu erreichen, so dass in jedem Bereich des Diagramms genügend Zellen für die Analyse vorhanden sind. Daher sollte der Forscher ein MOI von weniger als 1 anstreben (siehe Protokoll). Zu hohe oder zu niedrige Transduktions- und Infektionsraten führen zu Analyseproblemen aufgrund fehlender oder doppelt infizierter Zellen. Ebenso ist eine ähnliche Transduktionsrate für zu vergleichende SAMHD1-Vektoren der Schlüssel, damit die gleiche Kompensationsmatrix und Gating auf das gesamte Experiment angewendet werden kann, was das Vertrauen in die nachfolgende Analyse erhöht.
Zweitens ist das Alter der verwendeten U937-Zellen ein Schlüsselfaktor für ihre erfolgreiche Differenzierung. Eine erfolgreiche Differenzierung kann durch Beobachtung der Adhärenz, einer reduzierten Ansäuerung der Medien im Zeitverlauf nach Differenzierung und einer adäquaten Restriktion durch die Wildtyp-Positivkontrolle im Assay überwacht werden. Die Differenzierung von bis zu 5 Tagen war erfolgreich.
Einer der Hauptvorteile dieses Assays ist seine Flexibilität. Eine Vielzahl von modifizierten Versionen von SAMHD1 (Domänen, Aminosäuren, Speziessequenzen) kann durch einfache ortsgerichtete Mutagenese des Vektors oder Klonierung getestet werden. Ebenso können Varianten des Testervirus erforscht werden. Der Test wurde zuvor verwendet, um zu zeigen, dass HIV-1-Reverse-Transkriptase-Mutanten mit reduzierter Fähigkeit, dNTP zu binden, empfindlicher auf SAMHD1-Restriktion reagieren. Das gleiche Prinzip kann verwendet werden, um die Einschränkung anderer Viren durch SAMHD1 zu testen. Darüber hinaus können unterschiedliche Differenzierungsbedingungen oder künstliche Manipulation intrazellulärer dNTP-Konzentrationen verwendet werden, um die Interaktion zwischen intrazellulären Bedingungen und SAMHD1-Aktivität weiter zu untersuchen, ein Bereich aktiver Forschung im Bishop-Labor. Die Wechselwirkung von SAMHD1 mit verschiedenen nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitoren wurde ebenfalls beschrieben, und die Wirkung von SAMHD1 wurde unter Verwendung dieses Assays für die Verwendung in Primärzellenmodifiziert 12,13,14,15.
Die Anpassung des Protokolls für die Verwendung in Primärzellen überwindet die Einschränkungen, die sich aus der Untersuchung metabolischer Phänotypen in transformierten Zellen ergeben. Das bestehende Format ermöglicht jedoch ein komfortables und technisch weniger anspruchsvolles Protokoll für Hochdurchsatzanalysen, insbesondere bei Verwendung eines Durchflusszytometers mit einem Hochdurchsatz-Sampler. Bei der Anpassung des Protokolls sollte die Anfälligkeit der intern nicht transduzierten Zellen für Bystander-Effekte (z. B. Immunsignalisierung) berücksichtigt werden.
Wie bei vielen Aspekten der Zellbiologie ist es wichtig, dass solche Assays als Teil eines ganzheitlichen Ansatzes zum Verständnis eines bestimmten Phänomens verwendet werden. Die parallele Verwendung biochemischer Assays für die SAMHD1-Aktivität16, die Quantifizierung intrazellulärer dNTP-Pools und die Beobachtung von SAMHD1-mutierten Phänotypen beim Menschen, ex vivo und in Tiermodellen (die von Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden, einige werden in dieser Ausgabe beschrieben) sind der Schlüssel zum sich entwickelnden Verständnis dieses komplexen Proteins.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom Francis Crick Institute unterstützt, das seine Kernfinanzierung von Cancer Research UK (FC001042 und FC001162), dem UK Medical Research Council (FC001042 und FC001162) und dem Wellcome Trust (FC001042 und FC001162) erhält, und durch einen Wellcome Trust Investigator Award an JPS (108012 / Z / 15 / Z). Die Arbeit an der University of Cambridge wurde vom NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) und dem UK Medical Research Council (MR/S009752/1) kofinanziert. Der letztgenannte vom Vereinigten Königreich finanzierte Preis ist Teil des von der Europäischen Union unterstützten EDCTP 2-Programms.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |