Dette papir har til formål at give en protokol for isolering og kultur af primære kræft-associerede fibroblaster fra en syngeneic murin model af triple-negativ brystkræft og deres anvendelse for den prækliniske undersøgelse af nye nanopartikler designet til at målrette tumor mikromiljø.
Kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er centrale aktører i forbindelse med tumor mikromiljø. På trods af at være reduceret i antal i forhold til tumorceller, CAF’er regulere tumor progression og yde beskyttelse mod antitumor immunitet. Nye anticancer strategier har til formål at ombygge tumor mikromiljø gennem ablation af pro-tumorigenic CAFs eller omprogrammering af CAFs funktioner og deres aktivering status. En lovende tilgang er udviklingen af nanosized leveringsmidler, der er i stand til at målrette CAF’er, hvilket muliggør specifik levering af lægemidler og aktive molekyler. I den forbindelse kan en cellulær model af CAF’er være et nyttigt redskab til in vitro-screening og indledende undersøgelse af sådanne nanoformuleringer.
Denne undersøgelse beskriver isolation og kultur af primære CAF’er fra syngeneic 4T1 murine model af triple-negativ brystkræft. Magnetiske perler blev brugt i en 2-trins adskillelse proces til at udtrække CAF’er fra dissocierede tumorer. Immunophenotyping-kontrol blev udført ved hjælp af flowcytometri efter hver passage for at kontrollere procesudbyttet. Isolerede CAF’er kan anvendes til at studere målretning kapacitet forskellige nanoformuleringer designet til at tackle tumor mikromiljø. Fluorescerende mærket H-ferritin nanocages blev brugt som kandidat nanopartikler til at oprette metoden. Nanopartikler, enten nøgne eller konjugeret med en målretning ligand, blev analyseret for deres binding til CAF’er. Resultaterne tyder på, at ex vivo udvinding af bryst CAF’er kan være et nyttigt system til at teste og validere nanopartikler til specifik målretning af tumorigenic CAFs.
I løbet af de sidste årtier er det blevet klart, at dræbe tumorceller normalt ikke er tilstrækkeligt til at udrydde malignitet, da tumormikromiljøet kan fremkalde tumor tilbagefald og fremkalde terapeutisk resistens1,2. Et nyt paradigme er derefter opstået: målretning tumor stroma at fratage tumoren af understøttende faktorer og dermed øge effekten af kemoterapi3,4,5. Især kræft-associerede fibroblaster (CAFs) er en interessant stromal mål i mange solide tumorer6,7. CAF’er er en meget heterogen gruppe af celler, der interagerer med kræftceller og celler i immunsystemet gennem udskillelse af vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner; opbygge og ombygge den ekstracellulære matrix; og aktivere metastaseformation8,9,10,11,12. Afhængigt af tumortypen viser CAF’er pro-tumorigenic funktioner, mens andre undertyper af CAF’er ser ud til at have tumornedsættende funktioner13,14. For bedre at afklare denne dikotomi er en grundig karakterisering af CAF’er fra primære og metastatiske tumorer vigtig.
I denne sammenhæng har et nyt forskningsfelt fokuseret på udvikling af nanosized agenter designet til at målrette og / eller ødelægge CAF’er ved at levere aktive molekyler og lægemidler, der er i stand til at ombygge tumormikromiljøet15,16,17,18. Flere typer af nanopartikler er designet til at opnå CAF ablation af cytotoksiske lægemidler, at fremkalde CAF-målrettet fotodynamisk terapi, eller at omprogrammere CAF’er ved at vende tilbage dem til en quiescent tilstand eller fremkalde TNF-relaterede apoptose induceret ligand udtryk, som fremkalder apoptose af tilstødende kræftceller16,19. Desuden giver mange nanopartiklers potentiale til aktivt at målrette specifikke biologiske markører anledning til håb om at vælge CAF-delmængder, der skal målrettes. Selv om dens absolutte specificitet for CAF stadig er spørgsmålstegn ved, fibroblast aktivering protein (FAP) er en af de mest lovende mål for pro-tumorigenic stroma og udnyttes til at styre nanodrug levering, og dermed bane vejen for udviklingen af CAF-målretning nanoterapeutik20,21,22.
Dette papir beskriver isolering af primære CAF’er fra en syngeneic model af murin brystkræft og rapporterer deres anvendelse i undersøgelsen af målretning evne nanopartikler manipuleret til at genkende CAF markør, FAP. Ferritin nanocages anvendes som kandidat nanosystemer til at oprette metoden, da deres specificitet af levering kan formes ved overfladeeksponeringen af målretning moieties23,24. Desuden har ferritiner med succes vist sig at være fremragende biokompatierbare shuttles til antitumor applikationer, udløser hurtig ophobning af nyttelasten i tumormassen25,26,27. Til dato har prækliniske undersøgelser af CAF-målretning nanosystemer involveret in vitro-test på fibroblast cellelinjer stimuleret i kultur med omdanne vækstfaktor-beta til at fremkalde celle aktivering og udtryk for nogle immunophenotypic funktioner i CAFs28,29. Denne metode anvendes normalt på udødeliggjorte cellelinjer (såsom NIH3T3, LX-2) og er ret hurtig og enkel, hvilket giver aktiverede celler om et par timer eller dage. En begrænsning er, at selv om in vitro stimulation fremkalder ekspressionen af nogle gener tilskrives aktiverede myofibroblasts, kan det ikke helt generogulere alle de biologiske træk ved ægte CAF’er, især deres heterogenitet in vivo.
En anden strategi indebærer udvinding af primære CAF’er fra humane eller mus tumor prøver30,31. Dette sikrer, at CAF-aktivering sker i en fysiologisk sammenhæng, og at CAF-delpopulationernes heterogenitet opretholdes. Ifølge forskningsmålet kan CAF’er udledes af forskellige kilder, hvilket giver mulighed for at studere den mest pålidelige tilstand. Protokollen rapporteret her ville være værdifuldt for forskere, der søger at udføre en foreløbig evaluering af funktionaliteten af nye nanopartikler designet til at målrette CAF’er fra en murine brystkræft model. Isolerede CAF’er ville være nyttige til screening af de nanopartikler, der lover nok til at fortsætte til in vivoevaluering i dyremodeller af kræft. Dette vil være relevant i løbet af de første trin i nanopartikler produktion, kørsel nanoteknologi mod raffinement af nanopartikler design ved primært at overveje strategien for ligand immobilisering for at opnå optimale målretning egenskaber.
CAF’er er ved at opstå som centrale aktører i remodeling ekstracellulære matrix, fremme metastaser progression, og begrænse adgangen til stoffet til tumor site34. Men på grund af deres heterogenitet, deres roller er stadig kontroversielle-nogle CAF’er er tumorigenic, mens nogle andre undertyper synes at have en tumor-undertrykkende rolle. I denne sammenhæng kan deres isolation være af ekstrem interesse for at kaste mere lys over deres meget omdiskutussionelle rolle i kræft progression, som vil have vigtige kliniske konsekvenser12,31. Desuden vil vellykket CAF-udvinding fra humane og prækliniske musetumormodeller også lette udviklingen af nye CAF-målretningslægemidler. Dette papir rapporterer en metode til effektivt at isolere og kultur primære CAF’er fra en syngeneic præklinisk model af brystkræft. Baseret på erfaring påvirker tre eksperimentelle trin for det meste protokollens succes.
Den første arbejder hurtigt for at undgå sammenlægning af celleophæng forbundet med risikoen for koagulation i kolonnen og aftagende celle efflux: faktisk, når celler, der passerede gennem kolonnen blev grupperet sammen, sandsynligheden for en suboptimal isolationsproces steg, og de endelige kulturer indeholdt “forurenende” celle kloner. Den anden er at samle celler fra forskellige tumorer efter udtømning passage for at sikre nok celler, der skal passeres igennem i den endelige berigelse trin. Det sidste kritiske spørgsmål er plating de ekstraherede celler ved høje celletætheder, sandsynligvis startende fra en enkelt brønd af 24-brønd plade til at øge cellevækst og koloni ekspansion for op til 4-5 passager. Hvis cellerne blev sået ved lave tætheder, udvidede de sig på den frie overflade og stoppede hurtigt med at replikere.
Flere undersøgelser har allerede beskrevet CAF ekstraktion metoder af både menneskelig og mus oprindelse, at studere deres rolle i at fremme kræft udvikling og invasivitet. Dette er blevet gjort i mange typer af tumorer, herunder brystkræft, modermærkekræft, cholangiocarcinom, og bugspytkirtel adenocarcinom35,36,37,38. På grund af manglen på specifikke CAF-markører og deres heterogenitet er resultaterne af disse processer dog stadig suboptimale.
Her blev de isolerede celler brugt til at validere CAF-målretningsevnen hos HFn nanocages, der blev funktionaliseret med anti-FAP rettet mod moietier. Anvendelsen af primærkulturer i CAF’er var en betydelig fordel, hvilket gjorde det muligt at validere nanostrategi ex vivo med et meget enklere og omkostningseffektivt bindende eksperiment end at gøre det direkte in vivo i denne indledende fase af nanodrugoptimering.
I den forstand kan ex vivo-test på CAF’er gå forud for in vivo dyreforsøg ved at tillade screening og udvælgelse af de mest lovende nanopartikler til optimal målretning af CAF. CAF-modellen, der præsenteres her, kan også anvendes til indledende effektundersøgelser, når nanopartikler indlæses med aktive lægemidler. Dyr vil først blive brugt senere til at evaluere biodistribution, farmakokinetik og effektundersøgelser.
Flere CAF-målretning nanodrugs er ved at blive udviklet, såsom ferritin nanocages til fotodynamisk behandling i brystkræft og peptid-baserede partikler til at levere doxorubicin i prostatakræft modeller39,40. Der er dog ikke mange undersøgelser, der har fokuseret på isolering af CAF’er som celleplatforme til nanodrugoptimering.
Denne protokol har nogle begrænsninger. For det første er det en tidskrævende protokol, der kræver forberedelse og køb af flere reagenser og materialer. For det andet, på grund af knapheden på CAF’er i 4T1 brysttumor, deres udbytte er lav. Nanopartikler eksperimenter bør planlægges og udføres, så snart det krævede cellenummer er opnået, da primære CAF’er gennemgår senescence og ikke kan opretholdes i kulturen i lang tid. Afslutningsvis kan denne metode til CAFs isolation, dyrkning og karakterisering være et kraftfuldt værktøj til at fremskynde udviklingen af nye målrettede nanomediciner i kampen mod kræft.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) under IG 2017-ID. 20172-projektet – P.I. Corsi Fabio. SM anerkender Pædiatrisk Klinisk Forskningscenter “Romeo og Enrica Invernizzi”, der understøtter hendes position. AB takker AIRC (ID. 20172-projektet) og University of Milan for forskningsstipendi. LS og MS postdoctoral og ph.d.-stipendier er støttet af Universitetet i Milano.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |