Megakaryocyte الثقافة في هيدروجيل 3D ميثيلسليلوز القائم على تحسين نضوج الخلايا ودراسة تأثير تصلب والحبس
Summary
ومن المسلم به الآن أن البيئة ثلاثية الأبعاد للخلايا يمكن أن تلعب دورا هاما في سلوكها، والنضج و / أو التمايز. يصف هذا البروتوكول نموذج ثقافة الخلايا ثلاثي الأبعاد المصمم لدراسة تأثير الاحتواء المادي والقيود الميكانيكية على الخلايا العملاقة.
Abstract
البيئة ثلاثية الأبعاد التي تؤدي إلى كل من الحبس والقيود الميكانيكية معترف بها بشكل متزايد كمحدد مهم لسلوك الخلية. وهكذا تم تطوير الثقافة ثلاثية الأبعاد للتعامل بشكل أفضل مع الوضع في الجسم الحي. تفرق الخلايا الميغاكارية عن الخلايا الجذعية والذرية الدموية (HSPCs) في نخاع العظام (BM). وBM هي واحدة من أنعم الأنسجة في الجسم، محصورة داخل العظام. العظام يجري توسيعها بشكل سيئ على مقياس الخلية، تتعرض الخلايا الضخمة في الوقت المناسب إلى تصلب ضعيف والحبس عالية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لاستعادة نسب الماوس السلبية (لين) HSPCs عن طريق الفرز المناعي المغناطيسي وتمايزها إلى خلايا عملاقة ناضجة في وسط ثلاثي الأبعاد يتكون من الميثيلسليلوز. Methylcellulose غير تفاعلي تجاه الخلايا الضخمة ويمكن تعديل صلابته مع نخاع العظم الطبيعي أو زيادته لمحاكاة نخاع ليفي مرضي. كما تم تفصيل عملية استعادة الخلايا الضخمة لإجراء المزيد من التحليلات الخلوية في البروتوكول. على الرغم من أن يتم منع تمديد البروبليت داخل الوسط 3D، ويرد وصفه أدناه كيفية إعادة إنفاق الخلايا الضخمة في المتوسط السائل وتحديد قدرتها على تمديد proplatelets. ميغاكاريوسيوسيتيز نمت في هيدروجيل 3D لديها قدرة أعلى على تشكيل الصفائح مقارنة بتلك التي تزرع في بيئة سائلة. تسمح هذه الثقافة ثلاثية الأبعاد 1) بتفريق السلف نحو الخلايا الضخمة التي تصل إلى حالة نضوج أعلى ، 2) لتلخيص الأنماط الظاهرية التي يمكن ملاحظتها في الجسم الحي ولكنها تمر دون أن يلاحظها أحد في الثقافات السائلة الكلاسيكية ، و3) لدراسة مسارات النقل الناجمة عن الإشارات الميكانيكية التي توفرها بيئة ثلاثية الأبعاد.
Introduction
الخلايا في الجسم تجربة محيط 3D معقدة وتخضع للتفاعل بين الإشارات الكيميائية والميكانوفيزيقية بما في ذلك تصلب من الأنسجة والحبس بسبب الخلايا المجاورة والمصفوفة المحيطة 1،2،3. ولم يتم الاعتراف بأهمية الصلابة والحبس لسلوك الزنزانات إلا في العقود الأخيرة. وفي عام 2006، أبرز العمل الجوهري الذي قام به إنغلر وآخرون 4 أهمية البيئة الميكانيكية لتمايز الخلايا. أظهر المؤلفون أن الاختلاف في تصلب ركائز الخلايا أدى إلى اتجاه الخلايا الجذعية نحو أنساب مختلفة للتمايز. ومنذ ذلك الحين ، أصبح تأثير الإشارات الميكانيكية على مصير الخلايا وسلوكها معترفا به ودرس بشكلمتزايد. على الرغم من كونها واحدة من أنعم الأنسجة من الكائن الحي، ونخاع العظام لديه منظمة الهيكلية 3D التي تقتصر داخل العظام. تصلب النخاع، على الرغم من صعوبة من الناحية الفنية لقياس على وجه التحديد، ويقدر أن تقع بين 15 و 300 السلطة الفلسطينية 5،6. داخل ستروما، تقتصر الخلايا بإحكام على بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظمهم يهاجرون نحو الأوعية الجيوب الأنفية لدخول الدورة الدموية. وتخلق هذه الظروف قيودا ميكانيكية إضافية على الخلايا المجاورة، التي يتعين عليها التكيف مع هذه القوى. الإشارات الميكانيكية تمثل معلمة هامة التي تم استكشاف عواقبها على التمايز megakaryocyte وتشكيل البروبليت مؤخرا. على الرغم من أن megakaryocytes يمكن أن تفرق في المختبر في الثقافة السائلة التقليدية، فإنها لا تصل إلى درجة النضج لوحظ في الجسم الحي،ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الإشارات الميكانيكية من البيئة 3D 7. زراعة السلف جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل يجلب الإشارات الميكانيكية 3D التي تفتقر إلى الوسط السائل.
وقد استخدمت الهيدروجيلات على نطاق واسع لعدة عقود في مجال أمراض الدم، ولا سيما لزراعة الخلايا في مستعمرة تشكيل المقايسات لتحديد السلف الدموية. ومع ذلك، نادرا ما استخدمت هذه الهيدروجيلات لاستكشاف التأثير البيولوجي للبيئة الميكانيكية ثلاثية الأبعاد على نضوج وتمايز الخلايا الدموية. على مدى السنوات القليلة الماضية طور مختبرنا نموذج ثقافة ثلاثية الأبعاد باستخدام هيدروجيل هيدروجيل قائم على الميثيل سليلوز 8. هذا الجل المادي غير النشط هو أداة مفيدة لمحاكاة القيود المادية للبيئة megakaryocyte الأصلي. وهي مشتقة من السليلوز عن طريق استبدال بقايا الهيدروكسيل (-OH) بمجموعات ميثوكسيسيد (-OCH3). كل من درجة استبدال الميثيل وتركيز ميثيلسليلوز تحديد صلابة الهيدروجيل بمجرد أن الهلام. خلال مرحلة تطوير هذه التقنية ، ثبت أن معامل يونغ في نطاق 30 إلى 60 Pa هو صلابة الجل الأمثل لنمو الخلايا العملاقة 9.
يصف البروتوكول التالي طريقة لزراعة السلف العملاقة للفأرة في هيدروجيل ميثيلسليلوز ثلاثي الأبعاد. وقد ثبت سابقا أنه بالمقارنة مع الثقافة السائلة القياسية، هذه الثقافة الهيدروجيل يزيد من درجة تعدد الكريات البيض، ويحسن النضج والتنظيم داخل الخلايا، ويزيد من قدرة megakaryocytes لتمديد proplatelets مرة واحدة في إعادة إنفاقها في وسط السائل 9. تصف هذه المخطوطة بالتفصيل بروتوكول عزل خلايا نخاع العظم الماوس لين- وتضمينها في هيدروجيل ميثيلسليلوز للثقافة ثلاثية الأبعاد وكذلك تحديد قدرتها على إنتاج الصفائح الدموية واستعادة الخلايا لإجراء مزيد من التحليلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقد الماضي، أثار علم الأحياء الميكانيكية المزيد والمزيد من الاهتمام في العديد من مجالات علم الأحياء. ومن المسلم به الآن أن البيئة الميكانيكية المحيطة بالخلايا تلعب دورا في سلوكها ، مع التأكيد على أهمية دراسة كيفية إحساس الخلايا الضخمة والاستجابة للإشارات الميكانيكية خارج الخلية. م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا فابيان بيرتوي وأليسيا أغيلار اللذين طورا هذه التقنية في البداية في المختبر، وكذلك دومينيك كولين (معهد تشارلز سادرون – ستراسبورغ) الذي اتسم بالخصائص اللزوجية لهيدروجيل الميثيلسليلوز. وقد دعم هذا العمل من قبل جمعية إعادة التشكيل ومنظمة أطباء بلا حدود ومنحة من ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). جولي بوشر هي متلقية من مؤسسة من أجل Recherche Médicale (رقم منحة FRM FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
Riferimenti
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
