Megakaryozytenkultur in 3D-Methylcellulose-basiertem Hydrogel zur Verbesserung der Zellreifung und Untersuchung der Auswirkungen von Steifigkeit und Einschluss
Summary
Es ist jetzt anerkannt, dass die dreidimensionale Umgebung von Zellen eine wichtige Rolle bei ihrem Verhalten, ihrer Reifung und / oder Differenzierung spielen kann. Dieses Protokoll beschreibt ein dreidimensionales Zellkulturmodell, das entwickelt wurde, um die Auswirkungen von physikalischer Eindämmung und mechanischen Einschränkungen auf Megakaryozyten zu untersuchen.
Abstract
Die 3D-Umgebung, die sowohl zu Einschluss als auch zu mechanischen Einschränkungen führt, wird zunehmend als wichtige Determinante des Zellverhaltens erkannt. Die 3D-Kultur wurde daher entwickelt, um sich der In-vivo-Situation besser zu nähern. Megakaryozyten unterscheiden sich von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) im Knochenmark (BM). Der BM ist eines der weichsten Gewebe des Körpers, das im Knochen eingeschlossen ist. Da der Knochen auf der Zellskala schlecht dehnbar ist, werden Megakaryozyten gleichzeitig einer schwachen Steifigkeit und einer hohen Einschließung ausgesetzt. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Rückgewinnung von mouse lineage negative (Lin-) HSPCs durch immunmagnetische Sortierung und deren Differenzierung in reife Megakaryozyten in einem 3D-Medium aus Methylcellulose dar. Methylcellulose ist gegenüber Megakaryozyten nicht reaktiv und ihre Steifigkeit kann an die eines normalen Knochenmarks angepasst oder erhöht werden, um ein pathologisches fibrotisches Knochenmark nachzuahmen. Der Prozess zur Gewinnung der Megakaryozyten für weitere Zellanalysen ist ebenfalls im Protokoll detailliert beschrieben. Obwohl die Proplatelet-Erweiterung innerhalb des 3D-Milieus verhindert wird, wird im Folgenden beschrieben, wie die Megakaryozyten in flüssigem Medium resuspendiert und ihre Fähigkeit, Proplatelets zu verlängern, quantifiziert werden können. Megakaryozyten, die in 3D-Hydrogel gezüchtet werden, haben eine höhere Fähigkeit, Proplatelette zu bilden, verglichen mit denen, die in einem flüssigen Milieu gezüchtet werden. Diese 3D-Kultur ermöglicht es, i) Vorläufer in Richtung Megakaryozyten zu differenzieren, die einen höheren Reifezustand erreichen, ii) Phänotypen zu rekapitulieren, die in vivo beobachtet werden können, aber in klassischen flüssigen Kulturen unbemerkt bleiben, und iii) Transduktionswege zu untersuchen, die durch die mechanischen Hinweise einer 3D-Umgebung induziert werden.
Introduction
Zellen im Körper erleben eine komplexe 3D-Mikroumgebung und sind dem Zusammenspiel zwischen chemischen und mechanophysikalischen Hinweisen ausgesetzt, einschließlich Steifigkeit aus dem Gewebe und Einschluss aufgrund benachbarter Zellen und der umgebenden Matrix 1,2,3. Die Bedeutung von Steifheit und Einschluss für das Zellverhalten wurde erst in den letzten Jahrzehnten erkannt. Im Jahr 2006 hob die bahnbrechende Arbeit von Engler et al. 4 die Bedeutung der mechanischen Umgebung für die Zelldifferenzierung hervor. Die Autoren zeigten, dass die Variation der Zellsubstratsteifigkeit zur Orientierung von Stammzellen auf verschiedene Differenzierungslinien führte. Seitdem wird der Einfluss mechanischer Hinweise auf das Schicksal und Verhalten von Zellen zunehmend erkannt unduntersucht. Obwohl es eines der weichsten Gewebe des Organismus ist, hat das Knochenmark eine 3D-Strukturorganisation, die im Knochen eingeschlossen ist. Die Marksteifigkeit, obwohl technisch schwierig, genau zu messen, wird auf 15 bis 300 Pa geschätzt 5,6. Innerhalb des Stromas sind die Zellen eng aufeinander beschränkt. Darüber hinaus wandern die meisten von ihnen in Richtung der Sinusoidgefäße, um in den Blutkreislauf einzudringen. Diese Bedingungen erzeugen zusätzliche mechanische Einschränkungen für benachbarte Zellen, die sich an diese Kräfte anpassen müssen. Mechanische Hinweise stellen einen wichtigen Parameter dar, dessen Konsequenzen für die Megakaryozytendifferenzierung und Proplatletbildung erst kürzlich erforscht wurden. Obwohl Megakaryozyten in vitro in traditioneller Flüssigkultur differenzieren können, erreichen sie nicht den in vivobeobachteten Reifegrad, was zum Teil auf das Fehlen der mechanischen Hinweise aus der 3D-Umgebung zurückzuführen ist 7. Wachsende Vorläufer, die in Hydrogel eingebettet sind, bringen mechanische 3D-Hinweise, die im flüssigen Milieu fehlen.
Hydrogele werden seit mehreren Jahrzehnten im hämatologischen Bereich häufig eingesetzt, insbesondere um Zellen in koloniebildenden Assays zur Quantifizierung hämatopoetischer Vorläufer zu züchten. Solche Hydrogele wurden jedoch selten verwendet, um den biologischen Einfluss der mechanischen 3D-Umgebung auf die Reifung und Differenzierung hämatopoetischer Zellen zu untersuchen. In den letzten Jahren hat unser Labor ein 3D-Kulturmodell mit einem Hydrogel 8auf Methylcellulosebasis entwickelt. Dieses nicht reaktive physikalische Gel ist ein nützliches Werkzeug, um die physikalischen Einschränkungen der nativen Megakaryozytenumgebung nachzuahmen. Es wird aus Cellulose durch Ersatz von Hydroxylresten (-OH) durchMethoxidgruppen (-OCH3) gewonnen. Sowohl der Grad der Methylsubstitution als auch die Methylcellulosekonzentration bestimmen die Hydrogelsteifigkeit nach der Jellifikation. Während der Entwicklungsphase dieser Technik wurde gezeigt, dass ein Elastizitätsmodul im Bereich von 30 bis 60 Pa die optimale Gelsteifigkeit für das Megakaryozytenwachstum ist 9.
Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Züchtung von megakaryozytären Vorläuferzellen der Maus in einem 3D-Methylcellulose-Hydrogel. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Hydrogelkultur im Vergleich zur Standardflüssigkeitskultur den Grad der Megakaryozytenpolyploidisierung erhöht, die Reifung und intrazelluläre Organisation verbessert und die Fähigkeit von Megakaryozyten erhöht, Proplatele zu verlängern, sobald sie in einem flüssigen Medium resuspendiert sind 9. Dieses Manuskript beschreibt detailliert das Protokoll für die Isolierung von Lin−-Zellen aus dem Knochenmark der Maus und deren Einbettung in ein Methylcellulose-Hydrogel für die 3D-Kultur sowie die Quantifizierung ihrer Fähigkeit, Proplatelets herzustellen und die Rückgewinnung der Zellen für weitere Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten zehn Jahren hat die Mechanobiologie in vielen Bereichen der Biologie immer mehr Interesse geweckt. Es ist jetzt allgemein anerkannt, dass die mechanische Umgebung, die die Zellen umgibt, eine Rolle in ihrem Verhalten spielt, was die Bedeutung der Untersuchung betont, wie Megakaryozyten extrazelluläre mechanische Hinweise wahrnehmen und darauf reagieren. Es ist schwierig, die Steifigkeit des Knochenmarkgewebes in situ11genau zu messen, insbesondere wenn wir das hämatopoeti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Fabien Pertuy und Alicia Aguilar, die diese Technik zunächst im Labor entwickelt haben, sowie Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg), der die viskoelastischen Eigenschaften des Methylcellulose-Hydrogels charakterisierte. Diese Arbeit wurde von ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) und einem ARN-Stipendium (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) unterstützt. Julie Boscher ist Empfängerin der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-Förderkennzeichen FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
Riferimenti
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