세포 성숙을 개선하고 강성과 감금의 영향을 연구하기 위해 3D 메틸셀룰로오스 기반 하이드로겔의 메가카요세포 배양
Summary
이제 세포의 3차원 환경이 행동, 성숙 및/또는 분화에서 중요한 역할을 할 수 있음을 인정합니다. 이 프로토콜은 거대 카르요세포에 대한 물리적 봉쇄 및 기계적 제약의 영향을 연구하도록 설계된 3차원 세포 배양 모델을 설명합니다.
Abstract
감금과 기계적 제약으로 이어지는 3D 환경은 세포 행동의 중요한 결정요인으로 점점 더 인식되고 있습니다. 따라서 3D 배양은 생체 내 상황에 더 잘 접근하기 위해 개발되었습니다. 메가카요세포는 골수(BM)에서 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와 분화한다. BM은 뼈 안에 갇혀 있는 신체의 가장 부드러운 조직 중 하나입니다. 뼈는 세포 규모에서 제대로 확장되지 않으며, 메가카요세포는 약한 강성과 높은 감금을 수반한다. 이 프로토콜은 면역 자기 분류에 의한 마우스 계보 음성(Lin-) HSPC의 회수 방법을 제시하고 메틸셀룰로오스로 구성된 3D 배지에서 성숙한 메가카요사이클로 분화한다. 메틸셀룰로오스는 메가카요세포로 반응하지 않으며 그 강성은 정상적인 골수에 맞게 조정되거나 병리학적인 섬유질 골수를 모방하기 위해 증가될 수 있다. 추가 세포 분석을 위해 메가카요세포를 복구하는 프로세스는 또한 프로토콜에 상세합니다. 프로플라츠판 확장은 3D 밀리유 내에서 방지되지만, 액체 배지에서 거대 카르요퀴트를 재중단하고 프로플라츠를 확장하는 능력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 3D 하이드로겔에서 자란 메가카요세포는 액체 밀리우에서 자란 것과 비교하여 프로플라츠를 형성하는 더 높은 용량을 가지고 있습니다. 이러한 3D 배양은 i)가 더 높은 성숙 상태에 도달하는 메가카르요세포쪽으로 선조들을 구별할 수 있게 하고, ii) 생체내에서 관찰될 수 있지만 고전 액체 배양에서 주목받지 못하는 표현형을 회수하고, iii) 3D 환경에 의해 제공되는 기계적 단서에 의해 유도된 변환 경로를 연구할 수 있다.
Introduction
본체내 세포는 복잡한 3D 마이크로환경을 경험하고, 인접한 세포와 주변 매트릭스 1,2,3로인한 조직 및 감금으로부터의 강성을 포함하는 화학적 및 메카노물리적 단서 간의 상호작용을 받는다. 세포 행동에 대한 강성과 감금의 중요성은 지난 수십 년 동안만 인식되었습니다. 2006년, Engler 외 4의 정액 작업은 세포 분화를 위한 기계적 환경의 중요성을 강조했습니다. 저자는 세포 기질 강성의 변이가 다양한 분화 혈통을 향해 줄기 세포의 방향을 초래한다는 것을 보여주었습니다. 그 이후로, 세포 운명과 행동에 기계 단서의 영향은 점점 인식되고공부되고있다. 그것은 유기체의 가장 부드러운 조직 중 하나임에도 불구하고, 골수는 뼈 안에 갇혀 있는 3D 구조 조직을 가지고 있습니다. 골수 강성은 기술적으로 정확하게 측정하기 어렵지만 15 ~300 Pa 5,6사이에 있는 것으로 추정됩니다. 스트로마 내에서 세포는 서로 단단히 제한됩니다. 또한, 그들 대부분은 혈액 순환을 입력 하는 부비 동 성 혈관쪽으로 마이그레이션. 이러한 조건은 인접 한 셀에 추가 기계적 제약 조건을 만듭니다., 이러한 힘에 적응 해야. 기계적 단서는 메가카요세포 분화 및 프로플라틀 형성에 대한 결과가 최근에 탐구된 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 메가카요세포는 전통적인 액체 배양에서 시험관내에서 분화할 수 있지만, 3D환경으로부터의 기계적 단서가 없기 때문에 부분적으로 생체 내에서 관찰되는 성숙도에 도달하지 못하고 있다 7. 하이드로겔에 내장된 성장하는 선조는 액체 밀리우가 부족한 3D 기계적 단서를 제공합니다.
하이드로겔은 혈액학적 분야에서 수십 년 동안 널리 사용되어 왔으며, 특히 조혈 선조를 정량화하기 위해 식민지 형성 분석에서 세포를 성장시키는 데 사용되어 왔습니다. 그러나, 이러한 하이드로겔은 3D 기계적 환경이 조혈 세포의 성숙과 분화에 미치는 생물학적 영향을 탐구하는 데 거의 사용되지 않았습니다. 지난 몇 년 동안 우리의 실험실은 메틸 셀룰로오스 기반 하이드로겔 8을 사용하여 3D 배양 모델을 개발했습니다. 이 비반응성 물리적 젤은 네이티브 거대 카르요세포 환경의 물리적 제약을 모방하는 유용한 도구입니다. 그것은 메탈옥사이드 군(-OCH3)에의해 하이드록실 잔류물(-OH)의 대체에 의해 셀룰로오스로부터 유래된다. 메틸 대체정도와 메틸셀룰로오스 농도모두 젤화되면 하이드로겔 강성을 결정한다. 이 기술의 개발 단계에서, 30~60Pa 범위의 영의 계수는 메가카요세포 성장에 가장 적합한 겔 강성임을 입증했다 9.
다음 프로토콜은 3D 메틸셀룰로오스 하이드로겔에서 마우스 거대 촉매 선조를 성장시키는 방법을 설명합니다. 이전에는 표준 액체 배양과 비교하여, 이러한 하이드로겔 배양은 메가카요퀴트 폴리플로이이드화의 정도를 증가시키고, 성숙및 세포내 조직을 향상시키고, 액체 배지 9에서다시 중단된 프로플라틀을 연장하기 위해 메가카르요사이클의 용량을 증가시킨다는 것을 이전에 보여주었다. 이 원고는 마우스 골수 Lin−세포의 분리와 3D 배양을 위한 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 포함시키는 프로토콜과 추가 분석을 위한 프로플라틀을 생성하는 능력의 정량화를 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 10 년 동안, mechanobiology생물학은 생물학의 많은 지역에 점점 더 많은 관심을 제기했습니다. 이제 세포를 둘러싼 기계적 환경이 그들의 행동에 중요한 역할을 한다는 것을 일반적으로 인정하며, 메가카르요세포가 세포외 기계적 단서를 감지하고 반응하는 방법을 연구하는 것이 중요하다는 것을 강조합니다. 특히 대형 포유류의 궤적 뼈 내부에 위치하고 있는 조혈적 붉은 골수를 고려하는 경우…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 처음에 실험실에서이 기술을 개발 파비엔 퍼투이와 알리시아 아길라르뿐만 아니라 메틸 셀룰로오스 하이드로 겔의 점탄성 특성을 특징으로 도미니크 콜린 (연구소 찰스 사드론 – 스트라스부르)에게 감사드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 레체 에 데벨로페멘트 en Médecine et Santé Publique)와 ARN 보조금 (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics)에 의해 지원되었다. 줄리 보셔는 퐁디션 부어 라 레체쉬 메디칼 (FRM 교부번호 FDT202012010422)에서 받는 사람입니다.
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
Riferimenti
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
