该协议描述了Langendorff方法的修改,包括主动脉插管的深度,以便同时从成年小鼠中分离心房和心室肌细胞。
单个心肌细胞是心脏生物学和疾病的细胞和亚细胞水平研究中的重要工具,作为收缩和电活动的基本单位。因此,从心脏中分离出活的高质量心肌细胞是初始也是最关键的实验步骤。比较分离成年小鼠心肌细胞的各种方案,Langendorff逆行灌注是文献中报道的最成功和可重复的方法,特别是对于分离心室肌细胞。然而,从灌注的心脏中分离出高质量的心房肌细胞仍然具有挑战性,并且很少有成功的分离报告。解决这个复杂的问题非常重要,因为除了心室疾病,心房疾病占心脏病的很大一部分。因此,有必要在细胞水平上进行进一步研究以揭示其机制。本文介绍了一种基于Langendorff逆行灌注法的方案,对主动脉插管深度进行了一些修改,并同时对可能影响消化过程的步骤进行了一些修改,以分离心房和心室肌细胞。此外,分离的心肌细胞被证实适合膜钳检查。
心脏病是全球主要死亡原因之一1。为了解决医疗保健系统的这一负担,深入了解心脏的生理学和病理学至关重要。除了整只动物和完整的心脏准备外,细胞准备是功能和疾病研究的另一个不可或缺的工具2。通过应用膜片钳,钙成像,分子生物学和其他先进技术,研究人员可以获得有关单个心肌细胞(CM)中的电生理特性,钙稳态,信号通路,代谢状态和基因转录的更多信息。这对于揭示心脏病过程的生理和病理机制非常有帮助3,4,5,6,7。对于动物研究,可以使用从小型(例如,小鼠,大鼠和豚鼠)到大型(例如,兔子和狗)的动物。小动物通常是首选,特别是小鼠,因为它们适合遗传和疾病模型操纵8,9,10。
急性孤立的CM技术经历了漫长的发展期,并且仍在不断发展11。Langendorff逆行灌注是应用于大鼠和小鼠的最成功和可重复的CM分离方法,特别是用于分离心室肌细胞(VMs)12,13,14,15。然而,成功分离心房肌细胞(AMs)的报道很少16,17,18。有必要对整个器官/系统和细胞/亚细胞的两个水平进行进一步研究,以揭示其机制并探索新的治疗方法,因为心房颤动(AF)是最常见的心律失常类型,在全球范围内越来越普遍,并且目前在药物治疗和心脏消融术中的治疗方式在大约40%-50%的AF患者中仍然无效19.成功的成年小鼠CM分离是细胞研究的第一步。可以使用两种主要的隔离方法:chunk 和 Langendorff 方法。在Langendorff灌注法中,组织消化取决于冠状动脉及其分支输送到毛细血管床的酶溶液。适当的主动脉插管深度可以避免穿透主动脉瓣并阻塞冠状动脉口,这是实现这种灌注模式的先决条件,这也是有效消化和理想VM产量的关键步骤。因此,可以合理地假设主动脉插管的深度可能同样影响心房血管的灌注,并最终影响AM产量。为了验证这一假设,在不同深度进行了主动脉插管,并比较了相应的AM产量。结果表明,主动脉插缝深度与AM产量直接相关。本文介绍了一种同时隔离AM和VM的协议。
单CM是心脏功能和疾病细胞水平研究中有价值且不可或缺的工具20。因此,将可行的CM与人心隔离是第一步,也是最关键的一步。细胞质量是进行成功实验的重要决定因素之一,特别是在光学和电生理实验中。与其他动物的CM相比,啮齿动物CM更容易出现缺血和缺氧,因为细胞内钠离子浓度较高,有利于钙通过Na + / Ca2 + 交换剂流入21。此外,AM的数量远远少于VM的数量。因此,成功隔离是极其困难的。Langendorff方法非常适合分离小鼠VMs22,但分离AM的成功率很低,并且很少有报告可用。主动脉插管的适当深度也是产生理想VM的重要因素,除了用于缓冲液制备的温度、酶活性、PH和水质。朗根多夫方法的原理依赖于心脏的逆行灌注。灌注后,主动脉瓣关闭;因此,灌注液被迫进入冠状动脉,通过血管分支输送酶溶液,并且心肌组织被均匀消化。为了达到这种循环模式,主动脉必须为插管和结扎保留足够的长度,插管尖端也不得穿透主动脉瓣或阻塞CA口。因此,可以合理推测主动脉插管的深度也与心房灌注有关,从而以类似的方式影响心房的消化功效和AM的产量。这里提出的方案证实了这一假设,优化细胞产量的关键步骤以及建议如下所述。
在步骤1.9中,为了更好地固定主动脉,建议使用带有凹口(或圆周凹槽)的20 G钝插管,距离尖端为1 mm。根据我们的经验,发现套管尺寸略大于主动脉直径,以防止套管尖端在插管过程中刺穿主动脉瓣,因为主动脉依靠其内在弹性,可以紧贴在套管中并产生摩擦,这在向前或向后移动调整插管深度时起到保护因素的作用。就缺口的位置而言,如果心脏太靠近插管尖端,由于重力,心脏在插管过程中很容易滑落。相反,如果距离太远,调整插管深度和结扎位置的空间将非常有限。鉴于这些情况,在步骤3.3中,在左颈总动脉之间横切主动脉(如图 2中的绿线)以确保主动脉足够长并且可以在升主动脉处进行插管和结扎更好。虽然在升主动脉处进行横断,但留有的插管长度至少可以将插管尖端固定在靠近主动脉根部的位置,并且在结扎后不会穿透主动脉瓣。主动脉的解剖结构和从套管尖端到CA窦的距离的测量表明,在左颈总动脉之间横切主动脉是达到适当的主动脉插管深度的理想位置。
发现插孔深度与心房的灌注有关,进而作为深度指示器。 图 4 显示,当深度位于升主动脉时,心房灌注良好,并且两个心耳都充气。然而,当深度位于(或接近)主动脉根部并且两个心耳都枯萎时,心房灌注不足。从膨胀的心耳产生的AM的总和可行计数更高(图8)。这些发现表明,主动脉插管深度可以以某种方式影响心房和心耳的灌注和消化,最终影响AM的产量和质量。AM的产量和质量被推断为与供应心房的血管的分布有关。Fernández等人的研究已经 证明了小鼠CA的起源和过程的各种异常。他们发现CA的眼孔是高度可变的,并不都位于主动脉窦。一些CA可能异常地起源于主动脉窦上方,称为高起飞口。一些 CA 可能起源于同一主动脉窦,心房血管的口就在附近。本研究中主动脉的解剖结构(图10)也与Fernández的发现一致。这可能是为什么如果套管深度不合适,则通过Langendorff方法隔离AM的尝试在很大程度上不成功的原因。因此,如果套管尖端和CA口之间没有足够的空间,插管尖端将有更大的机会阻塞与CA窦相邻的心房血管窦。相比之下,只要导管尖端不穿透主动脉瓣,心室的灌注和细胞产量就几乎不受影响。这可能是因为向心室供血的CA具有更大的骨质和更多的起源。如果一个肺口管阻塞,心室灌注可以通过另一个 CA 或侧支循环来补偿,而供应心房的血管相当小并且没有替代品。因此,主动脉插管深度的影响很重要。
消化和细胞储存过程中其他值得注意的因素和故障排除如下。首先,考虑在步骤4.1中灌注含氧的Tyrode溶液,以使肌肉收缩,如果主动脉结扎后心房中的血液尚未冲出,则泵出残留的血液。这可以帮助避免从受损红细胞释放的ca2 + 和其他物质的不良反应。其次,提前注入无ca2+溶液以解离连接并扩大细胞之间的空间可以提高酶消化的功效,因为CM之间的插层盘是钙依赖性的细胞间连接。但是,时间应限制在3-5分钟,以避免 钙悖论 现象24。建议使用混合酶溶液。II型胶原酶破坏细胞外基质网络,如果胶原酶II消化不完全,胰蛋白酶有助于清除残留在细胞表面的颗粒状物质。这确保了电池表面的光滑,这对于在膜片钳记录中形成GΩ密封至关重要。然而,胰蛋白酶浓度应控制在适当的范围内,以避免过度消化和细胞损伤,因为它会降解膜蛋白。单独使用II型胶原酶来提高细胞产量通常可能导致组织过度消化,并且在长时间胶原酶暴露后分离出的CM将不耐钙25。2,3-丁二酮一毒杆菌(BDM)的使用仍然存在争议26,27,28,29,这是一种通过抑制肌球蛋白ATP酶和防止交叉桥形成来防止自发收缩的物质。根据以前的经验,添加 BDM 对于此协议是必需的。酶溶液用溶液1制备,尽管溶液1不含钙,并且添加钙以激活酶。在灌注溶液中添加BDM的好处包括(1)抑制肌细胞收缩和减少酶溶液灌注过程中的氧气消耗,以及(2)防止肌细胞缺氧和提高分离的肌细胞的质量。一些研究报告说,BDM可能对细胞电性能产生潜在的不利影响。然而,全细胞膜片钳记录钠电流的结果并不表明不良影响。在细胞储存步骤(步骤6)中,许多研究选择了KB缓冲液,一种无钙但高钾浓度的溶液,其中细胞可以保持更好的状态,因为它们处于极化和低代谢条件下。然而,在没有外源钙的情况下,细胞膜的糖萼会从脂质双层中分离出一定时间,膜通透性会增加,影响后续的功能分析30,31,32。
目前,所有肌细胞分离技术基本上可以分为酶溶液中的 块 状(一小块组织)消化或酶溶液中的CA灌注(Langendorff灌注)22。与Langendorff方法相比, 块 消化方法更容易执行,并且也经常用于许多实验室的CM分离。然而,这种方法通常从成人组织中产生低质量的CM产量22。此外,通过这种方法分离的细胞可能不适合进行比较实验。例如,当测试AM和VM之间的细胞类型特异性药物效应时,不能忽视或排除不同分离条件的影响。这是因为心肌和心室的组织密度比心房更厚,密度更大,导致消化时间和酶浓度不同。此外,在消化过程中对组织进行过度搅拌和移液会损害细胞并显着影响功能研究。此外,许多先前的研究表明,AMs更容易受到钙的影响。然而,通过当前方案分离的AM可以耐受梯度钙的再引入,可能是因为组织在消化过程结束时容易破裂。因此,机械损伤较小,而细胞将遭受更多的机械损伤,因为块状方法的步骤需要反复破裂和离心。最近,Ackers等人报告了 一种简化的,不含Langendorff的方法,用于分离活的心脏肌细胞和非肌细胞。虚拟机和成纤维细胞可以有效地分离,但没有提到AM的数量。但是,此协议有几个限制。首先,心脏血管的分布可能因个体差异和小鼠应变而有所不同,并且推荐的插管深度不能保证每次都能成功分离AM。其次,对于那些刚接触该手术的人来说,可能需要一定的时间来练习主动脉横断和逆行主动脉插管。最后,除了在健康和老年小鼠中外,这种方法没有在其他心脏病模型中进行测试。因此,由于心脏的纤维化程度,它需要调整酶浓度和消化时间。在块状方法中遇到的不同消化条件的缺点在Langendorff方法中不会成为问题,其中酶溶液通过血管床均匀地分布到组织中。
综上所述,这里描述的同时分离单个AM和VM的方案已经证明,适当的主动脉插管深度可以有效提高心房灌注和AM产量。通过该方法分离的CM质量高,具有良好的钙耐受性,并已成功应用于团队中的膜片钳记录和钙处理(通过 IonOptix系统测量Ca2 +释放和Ca2 + 波测量)34。预计分离方案可用于一系列细胞和亚细胞研究中的细胞制备,这将有助于加深对心脏生理学和病理学的理解。重要的是,它将能够发现更具临床相关性的心脏病机制和干预方法。
The authors have nothing to disclose.
本研究由国家自然科学基金(第81770322号、81870244号、81500254号、81870243号、81470465号)和北京市自然科学基金(第7192051号)资助。作者贡献:Bai和Liu设计并构思了这个项目。温家宝和阮为实验提供了宝贵的建议。吴和李琳玲进行了实验工作,并在数据采集、分析和解释中发挥了关键作用。李参加了朗根多夫装置的组装。彭、张、王、杨等在实验前参与了试剂和溶液的制备。吴写了这篇文章。
2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | 31550 | |
Bull Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Collagenase type II | Worthington | 43D14160 | |
Excel | data acquisition and analysis | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 150207 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
KHCO3 | Sigma-Aldrich | 237205 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Origin 8.5 | OriginLab, Northampton, MA,US | data acquisition and analysis | |
Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
Sodium pentobarbital | Shanghai Reagent Factory | 810923 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Trypan blue | Solarbio | C0040 | |
Trypsin | Invitrogen | 15090046 | |
Water bath | JULABO | ED (v.2) |