In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Summary

Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.

Abstract

Le piastrine sono prodotte da megacariociti, cellule specializzate situate nel midollo osseo. La possibilità di immagine dei megacariociti in tempo reale e del loro ambiente nativo è stata descritta più di 10 anni fa e getta nuova luce sul processo di formazione delle piastrine. I megacariociti estendono protrusioni allungate, chiamate proplatelet, attraverso il rivestimento endoteliale dei vasi sinusoidi. Questo documento presenta un protocollo per l'immagine simultanea in tempo reale di megacariociti marcati fluorescenti nel midollo osseo del cranio e nei vasi sinusoidi. Questa tecnica si basa su un intervento chirurgico minore che mantiene intatto il cranio per limitare le reazioni infiammatorie. La testa del topo è immobilizzata con un anello incollato al cranio per impedire ai movimenti di respirare.

Utilizzando la microscopia a due fotoni, i megacariociti possono essere visualizzati per un massimo di poche ore, consentendo l'osservazione di protrusioni cellulari e proplatelet nel processo di allungamento all'interno di vasi sinusoidi. Ciò consente la quantificazione di diversi parametri relativi alla morfologia delle sporgenze (larghezza, lunghezza, presenza di aree di costrizione) e al loro comportamento di allungamento (velocità, regolarità o presenza di pause o fasi di retrazione). Questa tecnica consente anche la registrazione simultanea delle piastrine circolanti nei vasi sinusoidi per determinare la velocità piastrinica e la direzione del flusso sanguigno. Questo metodo è particolarmente utile per studiare il ruolo dei geni di interesse nella formazione piastrinica utilizzando topi geneticamente modificati ed è anche suscettibile di test farmacologici (studiare i meccanismi, valutare i farmaci nel trattamento dei disturbi della produzione piastrinica). È diventato uno strumento inestimabile, soprattutto per integrare gli studi in vitro poiché è ormai noto che la formazione di proplatelet in vivo e in vitro si basa su meccanismi diversi. È stato dimostrato, ad esempio, che i microtubuli in vitro sono necessari per l'allungamento del proplatelet di per sé. Tuttavia, in vivo, servono piuttosto come un'impalcatura, l'allungamento è principalmente promosso dalle forze del flusso sanguigno.

Introduction

Le piastrine sono prodotte da cellule specializzate in megacariociti situate nel midollo osseo. Il modo preciso in cui i megacariociti rilasciano piastrine nella circolazione è rimasto a lungo poco chiaro a causa della sfida tecnica nell'osservare eventi in tempo reale attraverso l'osso. La microscopia a due fotoni ha contribuito a superare questa sfida e ha portato a importanti progressi nella comprensione del processo di formazione delle piastrine. Le prime osservazioni in vivo di megacariociti sono state fatte da von Andrian e colleghi nel 2007, con la visualizzazione di megacariociti fluorescenti attraverso il cranio¹. Ciò è stato ....

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS sull'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, project agreement N°: 2018061211274514).

1. Preparazione dei topi e inserimento di un catetere nella vena giugulare

NOTA: Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG maschi o femmine, di 5-7 settimane (B6.129 (Cg)-Gt (ROSA) 26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) Luo10}) incrociati con topi Pf4-....

Results

Utilizzando questo protocollo, il tracciante fluorescente, Qtracker-655, è stato somministrato per via endovenosa per l'immagine dei vasi sinusoidi del midollo anastomoso nel midollo osseo del cranio e la direzione del flusso come raffigurato dalle frecce(Figura 4A,a sinistra). Utilizzando mouse mTmG, le piastrine fluorescenti eGFP sono state registrate oltre 20 s in ogni ramo del vaso e la loro velocità è stata misurata utilizzando il software ImageJ e GNU Octave(Figura.......

Discussion

I meccanismi di formazione delle piastrine dipendono fortemente dall'ambiente del midollo osseo. Quindi, la microscopia intravitale è diventata uno strumento importante sul campo per visualizzare il processo in tempo reale. I topi con megacariociti fluorescenti possono essere ottenuti incrociando topi che esprimono la cre ricombinatasi in megacariociti con qualsiasi topo reporter floxed contenente una cassetta di espressione genica fluorescente condizionale. Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG (B6.129 (Cg) -.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software GNU Octave	Progetto		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	soluzione iniettabile di colla chirurgica
Rivelatori ibridi HyD Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Versione minima richiesta
Imalgene/Ketamina 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	protezione
per gli occhiMicroscopio Leica SP8 MP DIVE dotato di obiettivo ad acqua 25x, apertura numerica di 0,95	Leica Microsystems		Eccitazione simultanea di AlexaFluor-488 e Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Pasta dentale siliconica blu e gialla
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 etichetta vascolare	Invitrogen	Q21021MP	soluzione iniettabile
Scanner risonante, 8 o 12 kHz
Rompun Xilazina 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Gel			di supercollaper incollare l'anello all'osso
Catetere Surflo IV - Blu 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Laser pulsante Ti:Saph (Coerente) (femtosecondo)	Coerente