Här presenterar vi ett protokoll för den optimerade FlashPack kapillärkolonnförpackningsproceduren. Tillämpning av ett optimerat protokoll på en gemensam 100-bar tryckbombsinställning möjliggör 10 gånger snabbare packning och tillverkning av långa kapillärkolonner med ultrahög prestanda.
Kapillär ultrahög prestanda flytande kromatografi (UHPLC) är för närvarande en metod att välja för provseparationssteget i LC-MS-baserad proteomik. Kapillärkolumner är dock mycket mindre robusta i jämförelse med deras högre flödesräknare. På grund av enkel förorening och blockering behöver de ofta bytas ut. Det gör dem till en markant dyr del av den totala LC-MS-analyskostnaden. Intern packning av UHPLC kapillärkolumner sparar mycket pengar och möjliggör anpassning. Standardförpackningen i tryckbomben på 100 bar fungerar dock bra endast för HPLC-kolonner men är för långsam för UHPLC-sorbenter. Här ger vi en beskrivning av ett optimerat FlashPack-protokoll som tillämpas på samma 100-bar tryckbombsinställning. Metoden är baserad på förpackning från ultrahög sorbentkoncentrationsslam och är utvecklad för egen tillverkning av UHPLC kapillärkolonner med obegränsad längd inom rimlig tid.
Modern proteomik är baserad på vätskekromatografikopplad masspektrometri med den ultrahögprestanda nanoflödeskromatografi (50-150 μm kolumn interndiameter (ID)) separation som ger bästa analyshastighet och känslighet1. Medan många kommersiella UHPLC-kapillärkolumner finns tillgängliga, utgör deras pris en stor del av förbrukningskostnaden, särskilt när flera olika projekt drivs i laboratoriet och projektspecifik kolumnförorening är en vanlig fråga. Dessutom tillåter förpackning av kolumner internt användning av anpassade experimentspecifika sorbenter (t.ex. polyCAT-A sorbent2) och kolumnegenskaper som inte är tillgängliga för köp som en färdig kolumn.
För att klara av det packar många laboratorier kapillärkolonner internt. Det gemensamma förpackningsförfarandet med en 100 bar tryckbomb (tryckinsprutningscell)3 är dock dåligt lämpat för UHPLC-kolonnförpackningen på grund av högt baktryck av sub-2 μm UHPLC-sorbenter vilket resulterar i en dramatisk förpackningshastighetsminskning jämfört med större HPLC-sorbenter. Medan korta UHPLC-kolumner fortfarande kan vara mycket långsamt packade, är tillverkning av långa UHPLC-kolumner fysiskt omöjligt4.
Standard kapillär kolonn packning görs vid relativt låga tryck-upp till 100 barer, och med en mycket låg sorbent slurry koncentration. Därför finns det två möjliga riktningar för att påskynda processen. Det är möjligt att öka förpackningstrycket5. Detta kräver dock speciell utrustning och praktiskt taget installation av en ny metod i laboratoriet. Ett annat sätt är att öka sorbentslamkoncentrationen6. Hög sorbentslamhaltsförpackning beskrivs i kombination med ultrahögt förpackningstryck i en tidigare publikation7. Men vid 100 bar tryck, som används i de flesta av de befintliga förpackningsbomberna, resulterar högre sorbentkoncentration i antingen förpackningshastighet sakta ner eller direkt förpacknings upphörande. Effekten visade sig nyligen bero på sorbentkluster vid kolonningången, och ett enkelt trick av sorbent cupola destabilisering genom att hamra kolonningången med en magnetstång inuti en sorbentflaska föreslogs4. Den resulterande metoden, som heter FlashPack, använder samma 100-bar tryckbomb packning. Samtidigt tillåter mindre men kritiska förändringar i förpackningsförfarandet förpackning från mycket hög sorbent slamkoncentration och produktion av mycket långa UHPLC-kolonner (50 till 70 cm och längre) på mindre än en timme, medan en kort kolumn kan produceras på några minuter med separationskvaliteten lika med kommersiella kolumner med samma parametrar4. FlashPack-metoden användes redan framgångsrikt i flera proteomikprojekt för beredning av både omvänd fas (RP)8,9,10,11,12,13,14 och hydrofil interaktion (HILIC)2 kapillärkolumner.
Här beskriver vi i detalj de ändringar som behövs för anpassning av FlashPack-metoden till standard 100-bar tryckbombpackning.
Intern kapillär kolonnförpackning är mycket populär i stora laboratorier som arbetar med flera oberoende projekt. En vanlig förpackningsmetod från en låg koncentration sorbent suspension har dock stora begränsningar i hastigheten och kan inte producera långa UHPLC kolonner.
FlashPack är en ändring av standardförpackningen som gör det möjligt att packa från en mycket hög sorbentkoncentration. Den teoretiska grunden för metoden ligger i den kontinuerliga sorbent cupola destabiliseringen vid kolonningången under hela packningstiden. Det senare uppnås tekniskt genom att kolonningången kontinuerligt träffas med en magnetstång. Metoden för cupola destabilisering är avsiktligt utvecklad för att ha förpackningsinställningen helt lik den gemensamma förpackningsprocessen, men tricket med FlashPack ligger i detaljerna i sorbentslamberedningen, kapillärpositionering och magnetstånganvändning under förpackningsprocessen.
Sorbentslammet framställs som sedimentsorbentskikt i en stor lösningsmedelsvolym. Det är intressant att den tryckbombsbaserade packningen inte kräver samma förpackningsvillkor för kolonn till kolumn. I FlashPack vet vi aldrig den exakta sorbentslamkoncentrationen runt kolonningången. Det är omöjligt att mäta och kontrollera exakt, eftersom det också ändras under förpackningsprocessen. De slutliga kolumnerna är dock fortfarande mycket reproducerbara4 oavsett hur förpackningen uppnåddes.
Grunden för den snabba packningen ligger i den effektiva sorbent cupola destabiliseringen. Av denna anledning är det viktigt att kontrollera sorbent som kommer in i kapillären och att upprätthålla de optimala kupolstabiliseringsförhållandena under hela förpackningstiden. Det finns flera möjliga problem som kan förhindra effektiv sorbentleverans. Några exempel på dessa är sorbent lager resuspension genom snabb magnetisk stång rotation, ineffektiva kupol destabilisering på grund av antingen fel relativ kapillär till magnetstång positionering eller för långsam magnet bar rotation. Själva frågorna och hur de ska hanteras diskuteras i detalj i protokollavsnittet.
När kolumnen har packats är huvudkolumnparametern som ska kontrolleras kolumnbaktrycket. De tryckvärden som anges i tabell 5 ger en referenspunkt till vad som förväntas för en av de populära sub 2 μm pärla storlek sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidigt kan ytterligare baktryck tillsättas av friten eller en för smalt dragen emitter och man bör ständigt övervaka för det. Om packning görs i en pulled emitter, föreslår vi fortfarande att mäta det förväntade kolonnbaktrycket för den specifika sorbent som används genom att packa fritted kapillärer först, och sedan för att se om den självmonterande friten lägger till för mycket. För eventuella högtrycksproblem bör du använda riktlinjerna i tabell 1 för att identifiera problemet.
Enligt vår erfarenhet fungerar en packad kolumn utan missfärgningar, luckor och med rätt baktryck i 100% av fallen och ger separationskvaliteten nära vad som kan förväntas från kolonnlängden och sorbentegenskaperna. En kolumn med missfärgningar är inte garanterad att fungera korrekt men kan fortfarande ge tillfredsställande resultat.
För det mesta, om det finns några problem med separationskvaliteten, kommer de inte från kolonnen själv, utan snarare från andra delar av separationssystemet, nämligen pumpar, lösningsmedel eller anslutningar. Särskilt potentiellt skadliga är alla anslutningar efter kolumnen. Dålig anslutning med en död volym mellan emittern och den fritted kolonnen leder till stor toppbreddning och svansning på grund av mycket låga flödeshastigheter i kapillärkromatografi.
En annan viktig fråga som är specifik för FlashPack-metoden är att den använder många dyra sorbenter i en fungerande sorbent slurryflaska. Kom ihåg att sorbentslammet i FlashPack är avsett för flera användningsområden. Ta hand om sorbenten. Undvik onödig magnetstångsrörning för att minska sorbentslipning-kom ihåg att stoppa rotationen så snart förpackningen är klar. Och lämna inte den öppna sorbentflaskan i tryckbomben för att undvika sorbenttorkning. Även om sorbenten fortfarande kan användas efter det, tar det tid att göra om sorbentslammet.
Metoden fungerar lika bra för både fritted kapillärer och pulled-emitter kapillärer. FlashPack-principen ökar förpackningshastigheten för kapillär-ID från 20 till 250 μm (mindre och större testades inte). Det är också tillämpligt på alla sorbenter, både helt och ytligt porösa, vi kunde testa (vilket återspeglar att sorbent cupola-formationen i hög sorbentslamkoncentration inte är begränsad specifikt till RP-sorbenter). Dessutom påverkar lösningsmedelsparametrar tydligt förpackningen enligt deras fysiska och kemiska egenskaper. Till exempel ger mindre trögflytande aceton ännu högre förpackningshastighet än metanol vid samma förpackningstryck. Men det är också mindre polart än metanol och minskar sorbentpartiklar som fastnar på varandra. Effekten i sig förhindrar sorbent kupolbildning i början av förpackningen när flödet fortfarande är högt. Men minskning av sorbent partikelinteraktion leder också till mindre tillförlitlig självmonterande fritbildning och mer frekvent pulled-end blockering under förpackningen. Så även om aceton är bättre för förpackning av fritted kapillärer, är den mindre lämplig för pulled-emitter kapillärer, med metanol som ett slamlösningsmedel som är långsammare men lämpligt för båda typerna av ändelse. Förpackning från hexan eller diklormetan (DCM) är extrema fall av byte till aceton från metanol: de är ännu mindre polära, så de förhindrar sorbent kupolbildning helt, men de är inte lämpliga för pulled-emitter packning alls. Dessutom noterades det att extremt låg DCM polaritet leder till sorbentpartiklar som fastnar på den inre kapillärväggen och gör ett tjockt lager på den. Skikttjockleken växer gradvis och slumpmässiga lokala block bildas vilket resulterar i att kolonnen packas i flera delar åtskilda av regioner utan sorbent. Sådan effekt observerades för C18 Peptide Aeris sorbent.
Ett annat observerat problem var YMC Triart C18 sorbent inte suspenderas i metanol ordentligt, men att bilda någon form av flingor. Det hindrar dock inte att det packas med FlashPack och ger mycket anständig separationseffektivitet (opublicerade data). Således, även om det inte var optimalt för vissa fall, var metanol det mest universella lösningsmedlet att fungera för alla testade sorbenter och kolonner. Det är nödvändigt att nämna att vi ännu inte analyserade hur olika slamlösningsmedel påverkar kolonnseparationseffektiviteten. Samtidigt är effektiviteten hos kolumner packade från metanol redan helt lika med kommersiella kolumner för samma sorbenter4.
FlashPack är inte den enda befintliga metoden för att förbättra förpackningshastigheten för UHPLC-kolumner. Snabb packning från hög sorbentslamkoncentration är också möjlig med användning av ultrahögtrycksförpackning7. Fördelen med FlashPack är att det är mycket enklare eftersom det inte kräver speciella ultrahögtryckspumpar och tryckbomber för sorbentleverans och kapilläranslutningar. Samtidigt visade det sig att kolonnerna som är packade vid extrema tryck kan ha separationseffektivitet högre än lägre tryckpackade kolumner17. Och medan FlashPack producerar kolumner som är identiska med kommersiella som används ijämförelsen 4, för vilka vi inte känner till förpackningsmetoden, testades det ännu inte hur FlashPack-kolumner står mot ultrahögtryckspackade kolumner.
Sammanfattningsvis kan den beskrivna FlashPack-metoden enkelt anpassas till det befintliga förpackningsprotokollet i laboratoriet med vissa justeringar gjorda i protokollet, medan installationen förblir helt densamma. Det påskyndar HPLC-kapillärkolonnen packning till minuter och möjliggör produktion av långa UHP-kapillärkolonner, vilket helt enkelt är omöjligt med standardförpackningsproceduren. Den totala ekonomin i tid och pengar för laboratoriet genom tillämpning av FlashPack-metoden kan räknas i tiotusentals euro per år. Dessutom öppnar möjligheten att producera UHP-kapillärkolumner lokalt möjligheterna till experimentanpassning som är omöjliga med tillgängliga kommersiella produkter.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av RSF-anslag 20-14-00121. Författarna tackar P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) för givande diskussioner.
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
laser puller | Sutter | P2000/F | |
magnet bar 2×5 mm | Merck | Z283819 | |
MeOH | Merck | 1.06018 | |
microspatula | Merck | Z193216 | |
PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
vortex | BioSan | V-1plus | |
Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |