Microchirurgische obstructie van teelballenfusie in Spodoptera litura
Summary
Aluminiumfolie werd microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen van Spodoptera litura om de fusie van testis te belemmeren. De procedure omvat invriezen, bevestigen, desinfecteren, incisie, plaatsen van de barrière, hechten, postoperatief voeren en inspectie. Deze aanpak biedt een methode om weefselvorming te verstoren.
Abstract
In plaats van genetische methoden zoals RNA-interferentie (RNAi) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 te gebruiken, werd een fysieke barrière microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen van Spodoptera litura om de impact van deze microchirurgie op de groei en reproductie ervan te bestuderen. Na het inbrengen van aluminiumfolie tussen de teelballen verliep de insectenvervelling tijdens de metamorfose normaal. De groei en ontwikkeling van insecten waren niet opmerkelijk veranderd; het aantal spermabundels veranderde echter als de fusie van teelballen werd gestopt door de microchirurgie. Deze bevindingen impliceren dat het blokkeren van testiculaire fusie het mannelijke voortplantingsvermogen kan beïnvloeden. De methode kan verder worden toegepast om de communicatie tussen organen te onderbreken om de functie van specifieke signaalroutes te bestuderen. In vergelijking met conventionele chirurgie vereist microchirurgie alleen bevriezingsanesing, wat de voorkeur heeft boven kooldioxide-anesthesie. Microchirurgie minimaliseert ook het operatiegebied en vergemakkelijkt de wondgenezing. De selectie van materialen met specifieke functies moet echter verder worden onderzocht. Het vermijden van weefselletsel is cruciaal bij het maken van incisies tijdens de operatie.
Introduction
Fusie is een veel voorkomend fenomeen bij de ontwikkeling van weefsels of organen. Voorbeelden zijn dorsale sluiting en thoraxsluiting bij Drosophila1 en morfogenese van het gehemelte, morfogenese van neurale buizen en morfogenese van het hart bij muizen en kippen2. CRISPR en RNAi zijn toegepast om de rol van genen in het fusieproces te onderzoeken2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) is een schadelijke polyfagote plaag die wijd verspreid is in tropische en subtropische gebieden van Azië, waaronder China4,5,6. De brede verspreiding van S. litura wordt deels toegeschreven aan zijn krachtige voortplantingsvermogen, dat relevant is voor de ontwikkeling van geslachtsklieren. Mannelijke onvruchtbaarheid is een benadering om deze plaag onder controle te houden. Zoals te zien is in de schematische figuur van de testiculaire structuur, worden de testikels omsloten door de testiculaire schede, inclusief de externe schede (peritoneale schede) en de binnenste basale lamina. De basale lamina strekt zich inwendig uit tot het folliculaire epitheel en scheidt het binnenste gedeelte van de testis in vier kamers genaamd follikels (figuur 1).
In de follikels ontwikkelt spermatogonia zich na mitose en meiose tot spermatozoa en vervolgens worden de spermatozoa in de spermazakken in dezelfde richting uitgelijnd om spermabundels te vormen7. Tijdens spermatogenese differentiëren de primaire spermatocyten in eupyreensperma’s of apyreensperma’s. Spermatocyten in de larvale fase ontwikkelen zich tot eupyreensperma met een lange staart verbonden met een kop van een langwerpige kern; deze kunnen eieren bevruchten. Omgekeerd ontwikkelen spermatocyten in de mid-popale fase zich tot apyreensperma met een afgedankte kern; deze zaadcellen helpen bij de overleving, beweging en bevruchting van eupyreensperma9,10. De 6e dag van de pop is de periode waarin de teelballen overvloedige eupyreen- en apyreenspermabundels hebben.
Figuur 1: Schematisch diagram van de testiculaire structuur van Lepidoptera insecten11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Testiculaire fusie komt voor bij de meeste insecten van de Lepidoptera-orde11,12, vooral bij die soorten die landbouwongedierte zijn. Testiculaire fusie verwijst naar een paar testikels die bilateraal groeien in de larvale fase, elkaar naderen en zich aan elkaar hechten en uiteindelijk integreren in een enkele gonade11. In Spodoptera litura gebeurt het tijdens metamorfose van het larvale naar het popstadium. Vanaf dag 1 van de 5e instar (L5D1) tot dag 4 van de 6e instar (L6D4) groeit het paar teelballen geleidelijk in omvang en wordt de kleur lichtgeel van ivoorwit. Het wordt zwak rood als het de prepupale fase bereikt (L6D5 tot L6D6). Twee bilaterale symmetrische teelballen naderen elkaar tijdens het prepupale stadium, versmelten tot één en draaien tegen de klok in (doral view) om een enkele testis te produceren in de pop- en volwassen fase11. Dit fenomeen komt niet voor bij zijderupsen, die een aanzienlijk economisch belang hebben en al 5000 jaar worden gedomesticeerd13. Er wordt dus aangenomen dat de fusie van de teelballen het voortplantingsvermogen verbetert.
Om de betekenis van Spodoptera litura testiculaire fusie te bepalen, is het belangrijk om de effecten van het blokkeren van het proces te onderzoeken. In dit protocol werd aluminiumfolie microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen om ze gescheiden te houden, en de daaruit voortvloeiende veranderingen in de ontwikkeling van de insecten en hun teelballen werden bestudeerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na microchirurgisch belemmeren van teelballenfusie in Spodoptera litura, nam het aantal spermabundels af, wat de hypothese ondersteunde dat deze fusie gunstig is voor het voortplantingsvermogen. Chirurgische manipulatie wordt al sinds het begin van de 20e eeuw gebruikt om de fysiologische ontwikkeling van insecten te bestuderen. Om te bepalen of de hersenzenuw wordt gereguleerd door metamorfose van insecten, voerden sommige onderzoekers procedures uit zoals ligatie en onthoofding op verschillende inse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Nrs.:31772519, 31720103916; ) en een open subsidie van het State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
Riferimenti
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. . Physiological systems in insects. , (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’ in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
