Ostruzione microchirurgica della fusione dei testicoli in Spodoptera litura
Summary
Il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per ostruire la fusione del testicolo. La procedura include congelamento, fissaggio, disinfezione, incisione, posizionamento della barriera, sutura, alimentazione postoperatoria e ispezione. Questo approccio fornisce un metodo per interferire con la formazione dei tessuti.
Abstract
Invece di utilizzare metodi genetici come l’interferenza dell’RNA (RNAi) e le brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / endonucleasi associate a CRISPR Cas9, una barriera fisica è stata inserita microchirurgicamente tra i testicoli di Spodoptera litura per studiare l’impatto di questa microchirurgia sulla sua crescita e riproduzione. Dopo aver inserito un foglio di alluminio tra i testicoli, la muta degli insetti durante la metamorfosi procedeva normalmente. La crescita e lo sviluppo degli insetti non sono stati notevolmente alterati; tuttavia, il numero di fasci di spermatozoi è cambiato se la fusione dei testicoli è stata interrotta dalla microchirurgia. Questi risultati implicano che il blocco della fusione testicolare può influenzare la capacità di riproduzione maschile. Il metodo può essere ulteriormente applicato per interrompere la comunicazione tra gli organi per studiare la funzione di specifiche vie di segnalazione. Rispetto alla chirurgia convenzionale, la microchirurgia richiede solo l’anestesia congelante, che è preferibile all’anestesia con anidride carbonica. La microchirurgia riduce anche al minimo l’area del sito chirurgico e facilita la guarigione delle ferite. Tuttavia, la selezione di materiali con funzioni specifiche richiede ulteriori indagini. Evitare lesioni tissutali è fondamentale quando si praticano incisioni durante l’operazione.
Introduction
La fusione è un fenomeno comune nello sviluppo di tessuti o organi. Gli esempi includono la chiusura dorsale e la chiusura del torace in Drosophila1 e morfogenesi del palato, morfogenesi del tubo neurale e morfogenesi cardiaca in topi e polli2. CRISPR e RNAi sono stati applicati per studiare i ruoli dei geni nel processo di fusione2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) è un parassita polifago dannoso che è ampiamente distribuito nelle aree tropicali e subtropicali dell’Asia, tra cui la Cina4,5,6. L’ampia distribuzione di S. litura è in parte attribuita alla sua potente capacità riproduttiva, che è rilevante per lo sviluppo delle gonadi. L’infertilità maschile è un approccio per controllare questo parassita. Come mostrato nella figura schematica della struttura testicolare, i testicoli sono racchiusi dalla guaina testicolare, compresa la guaina esterna (guaina peritoneale) e la lamina basale interna. La lamina basale si estende internamente per formare l’epitelio follicolare e separa l’area interna del testicolo in quattro camere chiamate follicoli (Figura 1).
Nei follicoli, gli spermatogoni si sviluppano in spermatozoi dopo mitosi e meiosi, e quindi gli spermatozoi nelle sacche spermatiche si allineano nella stessa direzione per formare fasci di spermatozoi7. Durante la spermatogenesi, gli spermatociti primari si differenziano in spermatozoi eupireni o spermatozoi apireni. Gli spermatociti nella fase larvale si sviluppano in spermatozoi eupireni con una lunga coda collegata a una testa di un nucleo allungato; questi possono fecondare le uova. Al contrario, gli spermatociti nella fase mid-pupal si sviluppano in spermatozoi apireni con un nucleo scartato; questi spermatozoi aiutano la sopravvivenza, il movimento e la fecondazione degli spermatozoi eupireni9,10. Il 6 ° giorno della pupa è il periodo durante il quale i testicoli hanno abbondanti fasci di spermatozoi eupirene e apirene.
Figura 1: Diagramma schematico della struttura testicolare degli insetti lepidotteri11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La fusione testicolare si verifica nella maggior parte degli insetti dell’ordine dei lepidotteri11,12, specialmente in quelle specie che sono parassiti agricoli. La fusione testicolare si riferisce a una coppia di testicoli che crescono bilateralmente nella fase larvale, avvicinandosi e aderendo l’uno all’altro, integrandosi infine in una singola gonade11. In Spodoptera litura, accade durante la metamorfosi dallo stadio larvale a quello pupale. Dal giorno 1 del 5 ° instar (L5D1) al giorno 4 del 6 ° instar (L6D4), la coppia di testicoli cresce gradualmente di dimensioni e il colore diventa giallo chiaro da bianco avorio. Diventa rosso tenue quando raggiunge la fase prepupale (da L6D5 a L6D6). Due testicoli simmetrici bilaterali si avvicinano l’un l’altro durante lo stadio prepupale, si fondono in uno e ruotano in senso antiorario (vista dorale) per produrre un singolo testicolo nelle fasi pupale e adulta11. Questo fenomeno non si verifica nei bachi da seta, che hanno una notevole importanza economica e sono stati addomesticati per 5000 anni13. Pertanto, si presume che la fusione dei testicoli migliori la capacità riproduttiva.
Per determinare il significato della fusione testicolare di Spodoptera litura , è importante indagare gli effetti del blocco del processo. In questo protocollo, il foglio di alluminio è stato inserito microchirurgicamente tra i testicoli per tenerli separati e sono stati studiati i conseguenti cambiamenti nello sviluppo degli insetti e dei loro testicoli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dopo aver ostruito microchirurgicamente la fusione dei testicoli in Spodoptera litura, il numero di fasci di spermatozoi è diminuito, il che ha supportato l’ipotesi che questa fusione sia benefica per la capacità riproduttiva. La manipolazione chirurgica è stata utilizzata per studiare lo sviluppo fisiologico degli insetti sin dall’inizio del 20 ° secolo. Per determinare se il nervo cranico è regolato dalla metamorfosi degli insetti, alcuni ricercatori hanno eseguito procedure come la legatura e …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) e da una sovvenzione aperta dello State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (No.: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
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