Mikrokirurgisk hindring av testikler Fusion i Spodoptera litura
Summary
Aluminiumsfolie ble mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene til Spodoptera litura for å hindre sammensmelting av testis. Prosedyren inkluderer frysing, festing, desinfeksjon, snitt, plassering av barrieren, suturering, postoperativ fôring og inspeksjon. Denne tilnærmingen gir en metode for å forstyrre vevsdannelse.
Abstract
I stedet for å bruke genetiske metoder som RNA-interferens (RNAi) og gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/CRISPR-assosiert endonuklease Cas9, ble en fysisk barriere mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene til Spodoptera litura for å studere virkningen av denne mikrokirurgien på veksten og reproduksjonen. Etter å ha satt inn aluminiumsfolie mellom testiklene, fortsatte insektsmelting under metamorfose normalt. Insektvekst og utvikling ble ikke bemerkelsesverdig endret; Imidlertid endret antall sædbunter hvis testikler fusjon ble stoppet av mikrokirurgi. Disse funnene antyder at blokkering av testikkelfusjon kan påvirke mannlig reproduksjonsevne. Metoden kan videre brukes til å avbryte kommunikasjon mellom organer for å studere funksjonen til spesifikke signalveier. Sammenlignet med konvensjonell kirurgi krever mikrokirurgi bare frysebedøvelse, noe som er å foretrekke fremfor karbondioksidbedøvelse. Mikrokirurgi minimerer også operasjonsområdet og letter sårheling. Valg av materialer med spesifikke funksjoner trenger imidlertid videre undersøkelser. Unngå vevsskade er avgjørende når du gjør snitt under operasjonen.
Introduction
Fusjon er et vanlig fenomen i vev eller organutvikling. Eksempler er dorsal lukking og thoraxlukking i Drosophila1 og ganemorfogenese, nevral tube morfogenese og hjertemorfogenese hos mus og kylling2. CRISPR og RNAi har blitt brukt til å undersøke genenes roller i prosessen med fusjon2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) er et skadelig polyfagisk som er utbredt i tropiske og subtropiske områder i Asia, inkludert Kina4,5,6. Den brede fordelingen av S. litura er delvis tilskrevet sin kraftige reproduktive evne, som er relevant for gonadutvikling. Mannlig infertilitet er en tilnærming for å kontrollere dette. Som vist i den skjematiske figuren av testikkelstruktur, er testiklene omsluttet av testikkelhylsen, inkludert den eksterne hylsen (peritonealhylse) og indre basal lamina. Basal lamina strekker seg internt for å danne follikulær epitel og skiller det indre området av testis i fire kamre kalt follikler (figur 1).
I folliklene utvikler spermatogonia seg til spermatozoa etter mitose og meiosis, og deretter er spermatozoa i sperm sacs justert i samme retning for å danne sædbunter7. Under spermatogenese skiller de primære spermatocyttene seg i eupyrene sædceller eller apyren sædceller. Spermatocytter i larvalfasen utvikler seg til eupyren sæd med en lang hale koblet til et hode av en langstrakt kjerne; disse kan gjødsle egg. Omvendt utvikler spermatocytter i midt-pupalfasen til apyren sæd med en kassert kjerne; disse sædcellene hjelper overlevelse, bevegelse og befruktning av eupyren sperm9,10. Den sjette dagen av puppen er perioden der testiklene har rikelig eupyren og apyrene sædbunter.
Figur 1: Skjematisk diagram over testikkelstrukturen til Lepidoptera insekter11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Testikkelfusjon forekommer i de fleste insekter av Lepidoptera-ordren11,12, spesielt i de artene som er landbruksskade skadedyr. Testikkelfusjon refererer til et par testikler som vokser bilateralt i larvefasen, nærmer seg og holder seg til hverandre, og til slutt integreres i en enkelt gonad11. I Spodoptera litura skjer det under metamorfose fra larvalen til puppetrinnet. Fra dag 1 av den femte instar (L5D1) til dag 4 av den sjette instar (L6D4), vokser testiklene gradvis i størrelse, og fargen blir lysegul fra elfenbenshvit. Den blir svak rød når den når prepupalfasen (L6D5 til L6D6). To bilaterale symmetriske testikler nærmer seg hverandre i forberedelsesfasen, smelter sammen til en og vri mot urviseren (doralvisning) for å produsere en enkelt testis i pupal- og voksenfasene11. Dette fenomenet forekommer ikke i silkeorm, som har betydelig økonomisk betydning og har blitt tammet i 5000 år13. Dermed antas det at testiklenes fusjon forbedrer reproduktiv evne.
For å bestemme betydningen av Spodoptera litura testikkelfusjon, er det viktig å undersøke effekten av å blokkere prosessen. I denne protokollen ble aluminiumsfolie mikrokirurgisk satt inn mellom testiklene for å holde dem skilt, og de påfølgende endringene i utviklingen av insekter og deres testikler ble studert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etter mikrokirurgisk hindring av testikler fusjon i Spodoptera litura, reduserte antall sædbunter, noe som støttet hypotesen om at denne fusjonen er gunstig for reproduktiv evne. Kirurgisk manipulasjon har blitt brukt til å studere den fysiologiske utviklingen av insekter siden tidlig på 1900-tallet. For å avgjøre om kranialnerven er regulert av insektmetamorfose, utførte noen forskere prosedyrer som ligasjon og halshugging på forskjellige insekter (inkludert Rhodnius prolixus av Hemi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Nos.:31772519, 31720103916; ) og et åpent tilskudd fra State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (No.: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
Riferimenti
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. . Physiological systems in insects. , (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’ in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
