Protoplasti isolati di cellule di polpa di mela sono stati caricati con un reagente fluorescente di calcio per rilevare la concentrazione citoplasmatica di Ca2+.
Cytosolic Ca2+ svolge un ruolo chiave nello sviluppo delle piante. L’imaging del calcio è il metodo più versatile per rilevare i cambiamenti dinamici nel Ca2+ nel citoplasma. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali di cellule pulpare mediante idrolisi enzimatica. I protoplasti isolati sono stati incubati con il reagente fluorescente a piccola molecola (Fluo-4/AM) per 30 minuti a 37 °C. Le sonde fluorescenti hanno colorato con successo il catosolico Ca2+ ma non si sono accumulate nei vacuoli. La3+,un bloccante dei canali Ca2+, ha diminuito l’intensità della fluorescenza citoplasmatica. Questi risultati suggeriscono che Fluo-4 / AM può essere utilizzato per rilevare cambiamenti nel Ca2 + citosolico nella polpa del frutto. In sintesi, presentiamo un metodo per isolare efficacemente i protoplasti dalle cellule carnise del frutto e rilevare Ca2+ caricando un reagente fluorescente di calcio a piccola molecola nel citoplasma delle cellule della polpa.
Ca2+ svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale vegetale e nel metabolismo1,2. Inoltre, regola i tratti di qualità della frutta3,4, tra cui durezza, contenuto di zucchero e suscettibilità a disturbi fisiologici durante la conservazione5,6. Il Ca2+ citoplasmatico svolge un ruolo importante nella trasduzione del segnale e regola la crescita e lo sviluppo delle piante7. Il disturbo dell’omeostasi cellulare del calcio può indurre la fossa amara nelle mele8, la malattia delle macchie marroni nelle pere9e il marciume ombelicale nei pomodori10, influenzando la qualità della frutta e causando gravi perdite economiche3,11. L’imaging del calcio ha una risoluzione spaziale e temporale sufficiente ed è un metodo importante per osservare la dinamica di Ca2+ nelle cellule viventi12,13.
Allo stato attuale, ci sono due metodi principali per l’imaging intracellulare del calcio nelle cellule vive: uno impiega sonde fluorescenti chimiche a piccole molecole14e l’altro è il sensore di codifica genica (GECI)15,16. Data la difficoltà di stabilire un sistema transgenico stabile negli alberi da frutto e uno sviluppo più lungo dei frutti, GECIS non è adatto per l’imaging a fluorescenza Ca2+ della frutta.
Le sonde fluorescenti a piccole molecole come Fluo-4 / AM hanno un vantaggio particolare: la loro forma di estere AM (derivato dell’estere acetoximetilico permeabile alle cellule) può essere facilmente caricata in massa nelle cellule viventi senza la necessità di trasfezione, il che la rende flessibile, rapida e non citotossica17. Fluo-4 / AM potrebbe essere caricato con successo nel tubo pollinico di Pyrus pyrifolia18 e Petunia,19 così come nelle cellule di guardia20 e nei capelli radicali di Arabidopsis21.
Allo stato attuale, ci sono pochi rapporti sulla colorazione a fluorescenza di calcio delle cellule della polpa22. Come importante elemento minerale, il calcio svolge un ruolo chiave nella crescita e nel controllo di qualità dei frutti degli alberi come le mele. I meli sono riconosciuti a livello mondiale come un’importante specie economica e le mele sono considerate un alimento sano23. In questo studio, abbiamo ottenuto protoplasti vitali dalla polpa del frutto della mela attraverso l’idrolisi enzimatica e poi caricato reagenti fluorescenti a piccole molecole nel citoplasma per rilevare Ca2 +.
In questo studio, protoplasti vitali sono stati ottenuti mediante idrolisi enzimatica. Si noti che questo metodo richiede mele fresche. Il presente protocollo consente il rapido isolamento di un gran numero di protoplasti dalla polpa di frutta per l’uso in studi di ricerca. L’applicabilità di questo metodo non è limitata a ‘Fuji’; anche i protoplasti della polpa di mela di ‘Dounan’ e ‘Honey Crisp’ possono essere estratti attraverso lo stesso protocollo (Figura supplementare S4). La soluzione di protopl…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal progetto di miglioramento delle varietà agricole della provincia di Shandong (2019LZGC007) e dal team di innovazione degli alberi da frutto del moderno sistema tecnologico dell’industria agricola dello Shandong (SDAIT-06-05).
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |