사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca2+ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.
사이토솔릭 Ca2+는 식물 개발에 중요한 역할을 합니다. 칼슘 이미징은 세포질에서 Ca2+의 동적 변화를 감지하는 가장 다양한 방법입니다. 이 연구에서는 효소 가수분해에 의해 펄프 세포의 생존 가능한 전도를 얻었습니다. 격리된 프토프러스트들은 37°C에서 30분 동안 소분자 형광 시약(Fluo-4/AM)으로 배양되었다. 형광 프로브는 성공적으로 염색 된 세포색 Ca2 + 그러나 vacuoles에 축적되지 않았습니다. La3+,Ca2+ 채널 차단제, 세포질 형광 강도 감소. 이러한 결과는 Fluo-4/AM이 과일 육체에서 세포색 Ca2+의 변화를 감지하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 요약하자면, 우리는 과일의 살 세포로부터 프톱서를 효과적으로 분리하고 펄프 세포의 세포질에 소분자 칼슘 형광 시약을 적재하여 Ca2+를 검출하는 방법을 제시한다.
Ca2+ 식물 신호 변환 및 신진 대사 에 중요 한 역할을1,2. 또한, 저장5,6동안 경도, 당도 및 생리장애에 대한 감수성을 포함한 과일 품질 특성3,4를조절한다. 세포질 Ca2+ 신호 변환에 중요 한 역할을 하 고 식물 성장 및 개발을 조절7. 세포칼슘 항상성의 교란은 사과8,배9의갈색 반점 질환,토마토(10)의배부패에 쓰라린 구덩이를 유도할 수 있으며, 과일 품질에 영향을 미치고 심각한 경제적 손실을 유발할 수있다 3,11. 칼슘 이미징은 충분한 공간 적 및 시간적 해상도를 가지며 살아있는 세포12,13에서Ca2+ 역학을 관찰하는 중요한 방법입니다.
현재, 살아있는 세포에서 세포내 칼슘 이미징을 위한 두 가지 주요 방법이 있다: 하나는 화학적 소분자 형광프로브(14)를채택하고, 다른 하나는 유전자 인코딩 센서(GECI)15,16이다. 과일 나무에 안정적인 형질 전환 시스템을 확립하고 더 긴 과일 발달의 어려움을 감안할 때, GECIS는 과일 Ca2 + 형광 화상 진찰에 적합하지 않습니다.
플루오-4/AM과 같은 소분자 형광 프로브는 특별한 장점이 있습니다: 그들의 AM 에스테르 형태(세포 투과성 아세톡시메틸 에스테르 유도체)는 형질, 급속및 비 세포독성17을만드는 형질이 없는 살아있는 세포에 쉽게 대량으로 적재될 수 있다. 플루오-4/AM은 피루스 피리폴리아18과 페투니아,19의 꽃가루 튜브에 성공적으로 적재될 수 있을 뿐만 아니라 가드셀(20)과 아라비도시스(21)의루트 모발에 탑재될 수 있다.
현재, 펄프세포(22)의칼슘 형광 염색에 대한 보고는 거의 없다. 중요한 미네랄 요소로서 칼슘은 사과와 같은 나무 과일의 성장과 품질 관리에 중요한 역할을 합니다. 사과 나무는 전 세계적으로 중요한 경제 종으로 인식되고, 사과는 건강한 음식으로 간주됩니다23. 이 연구에서는 효소 가수분해를 통해 사과 과일 펄프에서 실행 가능한 전도를 얻은 다음 소분자 형광 시약을 세포질에 로드하여 Ca2+를검출했습니다.
이 연구에서는, 생존 성 전도는 효소 가수 분해에 의해 얻어졌다. 이 방법은 신선한 사과를 필요로합니다. 본 프로토콜은 연구 연구에 사용하기 위해 과일 펄프에서 많은 수의 프토플라스트를 신속하게 격리할 수 있게 합니다. 이 방법의 적용가능성은 ‘후지’에 만전을 기하지 않습니다. ‘두난’과 ‘꿀 크리스프’의 사과 펄프의 프톱스트도 동일한프로토콜(보충 도면 S4)을통해 추출할 수 ?…
The authors have nothing to disclose.
이 사업은 산동성 농업다양성개선사업(2019LZGC007)과 산동현대농업산업기술시스템(SDAIT-06-05)의 과일나무 혁신팀이 지원했다.
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |