Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom
Summary
Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) worden veel gebruikt als in vivo model van gemetastaseerd melanoom. Zodra een primaire tumor is geïnduceerd door tamoxifenbehandeling, wordt een toename van de metastatische belasting waargenomen binnen 4-6 weken na inductie. Dit artikel laat zien hoe Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) beeldvorming kan worden gebruikt om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van de inguinale lymfeklieren te volgen door de toename van hun volume te meten.
Het UHFUS-systeem wordt gebruikt om verdoofde muizen te scannen met een lineaire UHFUS-sonde (22-55 MHz, axiale resolutie 40 μm). B-modus beelden van de inguinale lymfeklieren (zowel links als rechts) worden verkregen in een korte-asweergave, waarbij de dieren in dorsale lighouding worden geplaatst. Echografierecords worden verkregen met behulp van een stapgrootte van 44 μm op een gemotoriseerde mechanische arm. Daarna worden tweedimensionale (2D) B-modus acquisities geïmporteerd in het softwareplatform voor ultrasone beeldnabewerking en worden inguinale lymfeklieren semi-automatisch geïdentificeerd en gesegmenteerd in de verkregen cross-sectionele 2D-beelden. Ten slotte wordt automatisch een totale reconstructie van het driedimensionale (3D) volume verkregen, samen met de weergave van het lymfekliervolume, dat ook wordt uitgedrukt als een absolute meting.
Deze niet-invasieve in vivo techniek wordt zeer goed verdragen en maakt het mogelijk om meerdere beeldvormingssessies op hetzelfde proefdier gedurende 2 weken te plannen. Het is daarom ideaal om de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte te beoordelen.
Introduction
Melanoom is een agressieve vorm van huidkanker die zich vaak verspreidt naar andere huidplaatsen (subcutane metastasen), evenals naar lymfeklieren, longen, lever, hersenen en botten1. In het afgelopen decennium zijn nieuwe geneesmiddelen geïntroduceerd in de klinische praktijk en hebben ze bijgedragen aan het verbeteren van de levensverwachting van patiënten met gemetastaseerd melanoom. Er blijven echter beperkingen bestaan, waaronder variabele tijd tot en mate van respons, ernstige bijwerkingen en de toename van verworven resistentie1. Daarom is het cruciaal om gemetastaseerde verspreiding in een vroeg stadium te detecteren, d.w.z. wanneer het de lokale lymfeklieren bereikt.
Een biopsie van de lokale lymfeklieren (schildwachtklieren) wordt meestal uitgevoerd om te controleren op de aanwezigheid van melanoomcellen. Echografie grijpt echter aan als een niet-invasieve methode om metastatische betrokkenheid te detecteren, omdat het beter presteert dan klinische evaluatie en een onnodige biopsie kan helpen voorkomen2,3,4. Bovendien lijkt echografie geschikt voor lymfekliersurveillance, vooral in het geval van gevorderde leeftijd en/of comorbiditeiten5,6. De kenmerken die worden gedetecteerd door ultrasone analyse en die het onderscheid tussen normale en gemetastaseerde lymfeklieren mogelijk maken, omvatten verhoogde grootte (volume), verandering van vorm van ovaal naar rond, onregelmatige marge, veranderd echogeen patroon en veranderde (verhoogde) vascularisatie7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) zijn onlangs beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap als een weefselspecifiek en induceerbaar model voor gemetastaseerd melanoom8. In dit diermodel ontwikkelen primaire tumoren zich zeer snel: ze worden zichtbaar binnen 2-3 weken na de inductie van de overgang van wild-type (wt) Braf naar BrafV600E en van het verlies van Pten, terwijl ze binnen 4 weken een volume van 50-100 mm3 bereiken. In de volgende 2 weken gaat de groei van de primaire tumor gepaard met een progressieve toename van de metastatische belasting op andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen.
Braf/Pten-muizen zijn op grote schaal gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder de dissectie van signaalroutes die betrokken zijn bij melanoomgenese9,10, de identificatie van melanoomcellen van oorsprong11,12,13, en het testen van nieuwe therapeutische opties in termen van zowel gerichte therapie als immunotherapie8,14,15,16 . Specifiek gebruikten we Braf / Pten-muizen om aan te tonen dat verzwakte Listeria monocytogenes (Lmat) werkt als een anti-melanoomvaccin. Wanneer systemisch toegediend in de therapeutische setting, is Lmat niet geassocieerd met algehele toxiciteit omdat het zich selectief ophoopt op tumorplaatsen. Bovendien veroorzaakt het een opmerkelijke afname van de primaire melanoommassa en een vermindering van de metastatische belasting in de lymfeklieren en longen. Op moleculair niveau veroorzaakt Lmat apoptotische doding van melanoomcellen, wat ten minste gedeeltelijk te wijten is aan niet-celauto autonome activiteiten (rekrutering ter plaatse van CD4+ en CD8+ T-lymfocyten)16.
Wanneer Braf /Pten-muizen worden gebruikt voor melanoommodellering, kan de groei van primaire tumoren en subcutane metastasen worden gevolgd door remklauwmetingen. De betrokkenheid van lymfeklieren en longen moet echter worden onderzocht met behulp van een alternatieve techniek, mogelijk een niet-invasieve techniek waarmee onderzoekers hetzelfde dier in de loop van de tijd kunnen volgen. Dit artikel beschrijft het gebruik van echografie (figuur 1), gekoppeld aan een daaropvolgende 3D-volumetrische analyse van de verkregen gegevens, voor de longitudinale monitoring van de toename in grootte (volume) van inguinale lymfeklieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gegevens verkregen in deze studie bevestigen het vermogen van echografie om de metastatische betrokkenheid van inguinale lymfeklieren van het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te controleren. Zoals eerder aangetoond16, is deze techniek vooral nuttig om de werkzaamheid van medicamenteuze behandeling te beoordelen. Dit komt omdat het de monitoring van de verandering in lymfekliervolume in hetzelfde dier in de loop van de tijd mogelijk maakt, door de metingen verzameld bij t1 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen S. Burchielli (FTGM, Pisa) bedanken voor haar hulp bij dierprocedures. Dit werk werd ondersteund door ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionele financiering van LP; MFAG #17095 toegekend door AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro aan LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
Riferimenti
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
