Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten
Summary
El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) son ampliamente utilizados como modelo in vivo de melanoma metastásico. Una vez que un tumor primario ha sido inducido por el tratamiento con tamoxifeno, se observa un aumento en la carga metastásica dentro de las 4-6 semanas posteriores a la inducción. Este artículo muestra cómo las imágenes de Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) pueden ser explotadas para monitorear el aumento en la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales midiendo el aumento en su volumen.
El sistema UHFUS se utiliza para escanear ratones anestesiados con una sonda lineal UHFUS (22-55 MHz, resolución axial 40 μm). Las imágenes en modo B de los ganglios linfáticos inguinales (tanto del lado izquierdo como del derecho) se adquieren en una vista de eje corto, posicionando a los animales en reclinación dorsal. Los registros de ultrasonido se adquieren utilizando un tamaño de paso de 44 μm en un brazo mecánico motorizado. Posteriormente, las adquisiciones bidimensionales (2D) en modo B se importan a la plataforma de software para el posprocesamiento de imágenes de ultrasonido, y los ganglios linfáticos inguinales se identifican y segmentan de forma semiautomática en las imágenes 2D transversales adquiridas. Finalmente, se obtiene automáticamente una reconstrucción total del volumen tridimensional (3D) junto con la representación del volumen de los ganglios linfáticos, que también se expresa como una medición absoluta.
Esta técnica in vivo no invasiva es muy bien tolerada y permite la programación de múltiples sesiones de imagen en el mismo animal experimental durante 2 semanas. Por lo tanto, es ideal evaluar el impacto del tratamiento farmacológico en la enfermedad metastásica.
Introduction
El melanoma es una forma agresiva de cáncer de piel que a menudo se disemina a otros sitios de la piel (metástasis subcutáneas), así como a los ganglios linfáticos, los pulmones, el hígado, el cerebro y los huesos1. En la última década, se han introducido nuevos fármacos en la práctica clínica y han contribuido a mejorar la esperanza de vida de los pacientes con melanoma metastásico. Sin embargo, persisten limitaciones, incluyendo el tiempo variable y el grado de respuesta, los efectos secundarios graves y la insurgencia de la resistencia adquirida1. Por lo tanto, es crucial detectar la propagación metastásica en sus primeras etapas, es decir, cuando llega a los ganglios linfáticos locales.
Por lo general, se realiza una biopsia de los ganglios linfáticos locales (ganglios linfáticos centinela) para verificar la presencia de células de melanoma. Sin embargo, la ecografía se está afianzando como un método no invasivo para detectar la afectación metastásica, ya que supera la evaluación clínica y puede ayudar a evitar una biopsia innecesaria2,3,4. Además, la ecografía parece apropiada para la vigilancia de los ganglios linfáticos, especialmente en el caso de edad avanzada y/o comorbilidades5,6. Las características que se detectan mediante ecografía y permiten la diferenciación entre ganglios linfáticos normales y metastásicos comprenden aumento de tamaño (volumen), cambio de forma de ovalado a redondo, margen irregular, patrón ecogénico alterado y vascularización alterada (aumentada)7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratones genéticamente modificados (ratones Braf/Pten) se han puesto recientemente a disposición de la comunidad científica como un modelo tisular específico e inducible para el melanoma metastásico8. En este modelo animal, los tumores primarios se desarrollan muy rápidamente: se hacen visibles dentro de las 2-3 semanas posteriores a la inducción del cambio de Braf de tipo salvaje (wt) a BrafV600E y de la pérdida de Pten, mientras que alcanzan un volumen de 50-100 mm3 en 4 semanas. En las siguientes 2 semanas, el crecimiento del tumor primario se acompaña de un aumento progresivo de la carga metastásica en otros sitios de la piel, ganglios linfáticos y pulmones.
Los ratones Braf/Pten han sido ampliamente utilizados para múltiples propósitos, incluyendo la disección de vías de señalización implicadas en la melanomagénesis9,10, la identificación de células de melanoma de origen11,12,13 y la prueba de nuevas opciones terapéuticas tanto en términos de terapia dirigida como de inmunoterapia8,14,15,16 . Específicamente, utilizamos ratones Braf / Pten para demostrar que Listeria monocytogenes atenuada (Lmat) funciona como una vacuna contra el melanoma. Cuando se administra sistémicamente en el entorno terapéutico, Lmat no se asocia con toxicidad general, ya que se acumula selectivamente en los sitios tumorales. Además, causa una disminución notable en la masa de melanoma primario y una reducción en la carga metastásica en los ganglios linfáticos y los pulmones. A nivel molecular, Lmat provoca la muerte apoptótica de las células de melanoma, que se debe, al menos en parte, a actividades no autónomas celulares (reclutamiento in situ de linfocitos T CD4+ y CD8+)16.
Cuando se utilizan ratones Braf/Pten para el modelado de melanoma, el crecimiento de tumores primarios y metástasis subcutáneas se puede monitorear mediante mediciones de calibradores. Sin embargo, la afectación de los ganglios linfáticos y los pulmones debe investigarse utilizando una técnica alternativa, posiblemente una no invasiva que permita a los investigadores seguir al mismo animal a lo largo del tiempo. En este trabajo se describe el uso de la ecografía (Figura 1), junto con un posterior análisis volumétrico 3D de los datos obtenidos, para la monitorización longitudinal del aumento de tamaño (volumen) de los ganglios linfáticos inguinales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los datos obtenidos en este estudio atestiguan la capacidad de las imágenes ecográficas para monitorizar la afectación metastásica de los ganglios linfáticos inguinales del modelo de ratón Braf/Pten de melanoma metastásico. Como se ha demostrado anteriormente16, esta técnica es especialmente útil para evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico. Esto se debe a que permite el seguimiento del cambio en el volumen de los ganglios linfáticos en un mismo animal a lo largo del tiempo, c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por su ayuda con los procedimientos con animales. Este trabajo fue apoyado por ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiación institucional a LP; MFAG #17095 otorgado por AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro a LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
Riferimenti
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