È stato fornito un protocollo dettagliato di metodi di analisi dell'espressione differenziale per il sequenziamento dell'RNA: limma, EdgeR, DESeq2.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Tre metodi di analisi dell'espressione differenziale per il sequenziamento dell'RNA: limma, EdgeR, DESeq2
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) è una delle tecnologie più utilizzate nella trascrittomica in quanto può rivelare la relazione tra l'alterazione genetica e processi biologici complessi e ha un grande valore nella diagnostica, nella prognostica e nella terapia dei tumori. L'analisi differenziale dei dati RNA-seq è fondamentale per identificare trascrizioni aberranti e limma, EdgeR e DESeq2 sono strumenti efficienti per l'analisi differenziale. Tuttavia, l'analisi differenziale RNA-seq richiede determinate abilità con il linguaggio R e la capacità di scegliere un metodo appropriato, che manca nel curriculum di educazione medica.
Qui forniamo il protocollo dettagliato per identificare i geni differenzialmente espressi (DEG) tra il colangiocarcinoma (CHOL) e i tessuti normali attraverso limma, DESeq2 e EdgeR, rispettivamente, e i risultati sono mostrati in grafici vulcanici e diagrammi di Venn. I tre protocolli di limma, DESeq2 e EdgeR sono simili ma hanno passaggi diversi tra i processi di analisi. Ad esempio, un modello lineare viene utilizzato per le statistiche in limma, mentre la distribuzione binomiale negativa viene utilizzata in edgeR e DESeq2. Inoltre, i dati normalizzati del conteggio RNA-seq sono necessari per EdgeR e limma, ma non sono necessari per DESeq2.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per tre metodi di analisi differenziale: limma, EdgeR e DESeq2. I risultati dei tre metodi sono in parte sovrapposti. Tutti e tre i metodi hanno i loro vantaggi e la scelta del metodo dipende solo dai dati.
Introduzione
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) è una delle tecnologie più utilizzate nella trascrittomica con molti vantaggi (ad esempio, un'elevata riproducibilità dei dati) e ha notevolmente aumentato la nostra comprensione delle funzioni e delle dinamiche di processi biologici complessi1,2. L'identificazione di trascritti ablati in diversi contesti biologici, noti anche come geni differenzialmente espressi (DEG), è un passo chiave nell'analisi RNA-seq. RNA-seq consente di ottenere una profonda comprensione dei meccanismi molecolari e delle funzioni biologiche correlate alla patogenesi. Pertanto, l'analisi differenzia....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Aprire il programma R-studio e caricare il file R "DEGs.R", il file può essere acquisito da file / script supplementari.
1. Download e pre-elaborazione dei dati
- Scarica i dati di conteggio del sequenziamento ad alto rendimento (HTSeq) del colangiocarcinoma (CHOL) da The Cancer Genome Atlas (TCGA). Questo passaggio può essere facilmente ottenuto con il seguente codice R.
- Fare clic su Esegui per installare i pacchetti R.
- Fare clic su Esegui per caricare i pacchetti R.
if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
+ install.packages("BiocManager")
BiocManager::i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Esistono vari approcci per visualizzare il risultato dell'analisi dell'espressione differenziale, tra cui il diagramma del vulcano e il diagramma di Venn sono particolarmente utilizzati. limma ha identificato 3323 DEG tra il CHOL e i tessuti normali con il |logFC|≥2 e adj. P.Val <0,05 come soglie, tra cui 1880 erano down-regolati nei tessuti CHOL e 1443 erano up-regolati (Figura 1a). Nel frattempo, edgeR ha identificato i 1578 DEG down-regulated e i 3121 DEG up-regulated (
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbondanti trascrizioni ablate nei tumori possono essere facilmente identificate dall'analisi differenziale RNA-seq5. Tuttavia, l'applicazione dell'analisi dell'espressione differenziale RNA-seq è spesso limitata in quanto richiede determinate abilità con linguaggio R e la capacità di scegliere metodi appropriati. Per affrontare questo problema, forniamo un'introduzione dettagliata ai tre metodi più noti (limma, EdgeR e DESeq2) e tutorial per l'applicazione dell'analisi dell'espressione differenzi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Il manoscritto non è stato pubblicato prima e non è stato preso in considerazione per la pubblicazione altrove. Tutti gli autori hanno contribuito alla creazione di questo manoscritto per importanti contenuti intellettuali e hanno letto e approvato il manoscritto finale. Dichiariamo che non vi è alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860276) e dai Key Special Fund Projects del National Key R&D Program (Grant No. 2018YFC1003200).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| R | versione 3.6.2 | software gratuito | |
| Rstudio | software gratuito |
Riferimenti
- Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach. Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomic....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
